酸浆标准化生产工艺的研究

乔支红，闫　佳，陈　虹，许荣华

（北京联合大学旅游学院，北京100101）

酸浆标准化生产工艺的研究

乔支红，闫佳，陈虹，许荣华

（北京联合大学旅游学院，北京100101）

利用从豆腐酸浆老汤中筛选到的五株产酸菌，以大豆黄浆水为培养基，以酸浆的pH为考察指标，探讨了单菌发酵、双菌发酵、发酵温度、菌种接种量及菌种的混合比例对酸浆pH的影响。在单因素实验的基础上设计了正交实验，以确定酸浆纯种发酵的最佳生产工艺参数。结果表明：酸浆纯种发酵的最佳工艺参数为：双菌混合发酵，混合比例为1∶9（1号菌∶3号菌），接种量5%，发酵时间24h，发酵温度42℃。对正交实验的结果进行验证得到酸浆的pH为3.56。

黄浆水，酸浆，纯种发酵，标准化生产

酸浆豆腐是我国一种传统的豆腐制品，它是以酸浆（豆腐制作时排出的黄浆水自然发酵而成）作为凝固剂制作而成，口感细腻，后味清幽淡远，略带甘甜，属纯绿色食品，深受人们的喜爱［1］。然而，由于缺乏科学的指导，酸浆豆腐的制作始终是依靠人们多年的经验，没有一个科学的评价标准及量化指标，造成目前酸浆豆腐仍是农户自产自销，无法走出农村进入大城市［2-3］。因此，酸浆豆腐的工业化生产较为重要。

酸浆豆腐的工业化生产关键在于其凝固剂—酸浆的标准化生产。目前，我国民间酸浆的生产主要是以酸浆老汤作为发酵种子，将老汤加入新产生的黄浆水中，在室温下放置，经自然发酵成点浆所用的天然凝固剂［4-5］。自然发酵一方面，受环境因素的影响较大，很难控制酸浆的酸度［6］。环境温度高时，微生物繁殖快，酸浆很快能达到点浆所需的酸度，温度低时，需要较长时间才能达到，每天酸浆的酸度也不是很一致，导致生产的酸浆豆腐品质不稳定。另一方面，自然发酵过程中，除有益菌外，还有许多腐败杂菌的存在，从而会导致所生产的酸浆豆腐保质期短。若将酸浆的生产由自然发酵变为严格的纯种发酵，将会解决以上两方面的问题，这也正是酸浆标准化生产的意义所在。目前，国内也有对酸浆发酵的相关研究［7-9］，但均为单菌发酵，要达到点浆所需的酸度其发酵时间较长，工业化生产效率低。

本文以从民间获得的酸浆老汤中筛选得到的五株乳酸菌为研究对象，进行单因素实验，探讨单菌、双菌混合发酵时对酸浆pH的影响，选出产酸快的发酵菌种，进而探讨不同发酵温度、接种量及双菌混合比例对酸浆pH的影响，旨在确定出酸浆标准化生产的最佳工艺参数，为酸浆豆腐的标准化生产提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黄浆水由北京道尔泰商城豆腐店提供；培养基MRS液体、固体培养基［2］，北京蓝弋化工产品有限责任公司；菌种菌种来源如表1所示。

DHP-420BS培养箱天津市中环实验电炉公司；280电热（18L）灭菌锅上海申安医疗器械厂；BS224S电子天秤北京赛多利斯仪器公司；PHS-25酸度计上海精密科学仪器公司；100～1000μL移液枪日本立洋；SW-CJ-2FD超净台上海博迅实业有限公司；DH-101-OBS干燥器天津市中环实验电炉公司。

表1　菌种标号及其来源地Table 1　Lactobacillus and Source

1.2实验方法

1.2.1菌种活化用灭菌接种环从五个菌的斜面上挑取一环分别接种于5个装有5mL灭菌的MRS液体培养基的试管中，于37℃恒温培养箱中静置培养48h，菌种经两次活化后待用［10］。

1.2.2菌种扩大培养用移液枪分别从第二次活化好的MRS液体吸取0.4mL菌液于5个20mL灭菌的MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中静置培养48h。

1.2.3涂布数菌将菌种培养液用无菌生理盐水10倍稀释法稀释到10-4、10-5、10-6，涂布于灭菌的MRS固体培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培养48h，进行菌落计数。

1.2.4酸浆pH的测定用酸度计直接测定发酵好的酸浆。

1.2.5单因素实验设计

1.2.5.1单菌发酵取相同数量菌种（106CFU/mL）的菌液接入20mL灭菌的黄浆水中，于37℃的培养箱中静置培养，分别于2、4、6、8、10、12、16、20、24h取出测培养液的pH。

1.2.5.2双菌混合发酵将1号、3号、10号三种菌，两两组合按1∶1的比例，接种量为3%，接入20mL灭菌的黄浆水中，于37℃的培养箱中静置培养，分别于2、4、6、8、10、12、24h取出测培养液的pH。

1.2.5.3不同接种比例1号菌、3号菌的混合比例分别为1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，接种量均为3%，分别接入20mL灭菌的黄浆水中，于37℃的培养箱中静置培养，分别于2、4、6、8、10、12h取出测培养液的pH。

1.2.5.4不同接种量1号、3号菌的混合比例为5∶5，其接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，分别接入20mL灭菌的黄浆水中，于37℃的培养箱中静置培养，分别于2、4、6、8、10、12、24h取出测培养液的pH。

1.2.5.5不同发酵温度固定1号、3号菌的比例（5∶5），接种量5%，分别接入20mL灭菌的黄浆水中，于发酵温度分别为27、32、37、42℃的培养箱中静置培养，分别于2、4、6、8、10、12、24h取出测培养液的pH。

1.2.6正交实验设计在单因素实验的基础上，对黄浆水纯种发酵条件进行优化。以发酵时间、发酵温度、接种量、菌种混合比例四个因素为自变量，以酸浆的pH为测定指标，设计4因素3水平的正交实验L9（34）。因素水平见表2。

表2　正交实验因素水平表Table 2　Factors and levels of orthogonal experiment

2　结果与分析

2.1单菌发酵对酸浆pH的影响

黄浆水营养丰富，乳酸菌可利用黄浆水中的糖进行发酵产酸，使得黄浆水的pH下降。本研究采用从酸浆老汤中筛选的五株乳酸菌对黄浆水发酵，旨在筛选出产酸较快的乳酸菌。结果如图1所示。

图1　五种乳酸菌发酵酸浆pH的变化Fig.1　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by five single strains

从图1中可以看出，乳酸菌发酵24h内，随着发酵时间的延长，1号菌、3号菌和10号菌的pH总体呈下降趋势。其中3号菌pH下降较快，发酵12h时，黄浆水的pH达4.11，发酵24h时黄浆水的pH达3.72，说明3号菌发酵黄浆水产酸较快；而7号菌和9号菌发酵黄浆水24h内，其pH基本不变，说明7号菌和9号菌不能利用黄浆水中的糖发酵产酸。因此，本研究将对1号菌、3号菌及10号菌确定为酸浆标准化生产的产酸菌株，做进一步研究。

2.2双菌混合发酵对酸浆pH的影响

若将酸浆工业化生产，需提高生产效率，而酸浆在短时间内获得较低的pH较为重要，但单菌发酵产酸速度较慢（图2），24h时最低才达到3.72，不能保证高效率生产，故本研究将筛选出的三株产酸菌两两组合发酵黄浆水，探讨其发酵产酸的速度，结果如图2所示，在24h内，随着时间的延长，双菌组合发酵酸浆的pH总体呈下降趋势，与单菌相比，在相同时间上双菌发酵酸浆的pH下降速度明显比单菌快。且1号菌和3号菌组合发酵酸浆的pH始终保持最低，发酵12h时，黄浆水的pH就达到3.49，发酵24h时黄浆水的pH达3.20，说明双菌混合发酵比单菌发酵产酸速度快，酸浆的酸度下降快，将大大提高酸浆的生产效率。

图2　单菌和双菌混合发酵酸浆pH的变化Fig.2　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by five single strains and mixed strains

2.3双菌不同混合比例对酸浆pH的影响

对1号菌和3号菌不同的混合比例发酵黄浆水进行了研究，结果如图3所示，在12h内，随着发酵时间的延长，（1号菌∶3号菌）双菌的五种不同混合比例下酸浆的pH总体呈下降趋势，且5∶5组合的酸浆pH下降速度比其他组合更快，在12h时黄浆水的pH达3.29，故选用5∶5（即1∶1）组合为此条件下乳酸菌的最适混合比例。

图3　双菌不同混合比例发酵酸浆pH的变化Fig.3　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by mixed strains in different mixing ratio

2.4不同接种量对酸浆pH的影响

乳酸菌的不同接种量对黄浆水的发酵速度有着很大的影响［7］，本研究以1号菌和3号菌（1∶1）为发酵菌种，选取了五种不同的接种量研究不同接种量对酸浆pH的影响。结果如图4所示，在24h内，酸浆pH均呈下降趋势，在同一发酵时间下，随着接种量的增加，黄浆水的pH下降加快。从图4中可明显看出，当乳酸菌的接种量为5%时，酸浆的pH下降速度最快，且在同一发酵时间内，酸浆pH最低，在发酵24h时酸浆pH达3.84，说明5%的接种量为此条件下最佳的接种量。

图4　不同接种量发酵酸浆pH的变化Fig.4　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by mixed strains in different inoculum sizes

2.5不同发酵温度对酸浆pH的影响

温度对乳酸菌的生长起着至关重要的作用，不同温度下乳酸菌的繁殖速度不一样，发酵黄浆水的速度也不同，本研究选取了四种不同的发酵温度，观察不同发酵温度下酸浆pH的变化，结果如图5所示，在24h内，随着发酵时间的延长，酸浆的pH呈逐渐下降趋势，当发酵温度为42℃时，酸浆pH的下降速度最快，在发酵24h时酸浆pH可达3.84，说明42℃是混合乳酸菌发酵黄浆水的最佳发酵温度。

图5　不同发酵温度对发酵黄浆水的影响Fig.5　Changes in pH values of the acid whey during fermentation in different fermentation time

表3　正交实验结果Table 3　Results of orthogonal experiment

2.6正交实验

通过单因素实验结果得出了各个影响因素的最佳值，由此设计出正交实验表，进一步进行正交实验确定各因素作用的最佳组合。结果如表3所示，从表3中可以直观看出，9号实验组合，乳酸菌发酵黄浆水所得酸浆的pH最低为3.65。

从各列极差R的分析值看出，发酵时间R值最大（0.72），双菌（1号菌∶3号菌）混合比例R值最小（0.13），所以4个因素对结果影响大小顺序为：发酵时间＞发酵温度＞接种量＞混合比例。

分析各因素k值得出分析结果：最优的实验组合为A3B3C3D1，即酸浆标准化生产的最佳工艺参数为：发酵时间为24h，发酵温度为42℃，接种量为5%，双菌（1号菌∶3号菌）混合比例为1∶9。

该组实验组合在正交实验组合中未出现，因此，本研究对该组合进行了验证实验，当黄浆水在该工艺参数下发酵，所得酸浆的pH可达到3.56，能够满足酸浆豆腐生产的需要（本研究组曾赴云南建水、元阳，山东邹平，陕西榆林，河北涞源等地对当地酸浆豆腐进行调研，其制作酸浆豆腐所用的酸浆pH为3.5～4.0）。

3　结论

利用从酸浆老汤中筛选出的优势乳酸菌，通过单因素实验和正交实验得出酸浆纯种发酵的最佳生产工艺参数为：双菌（1号菌∶3号菌）混合比例1∶9，接种量5%，发酵时间24h，发酵温度42℃，以此工艺所得酸浆pH为3.56，可以达到酸浆豆腐点浆所需的标准，本研究的结果为酸浆豆腐的工业化进程提供了有力的前提保证。

［1］乔支红．乳酸菌发酵延长豆腐保质期及抑菌机理的研究［D］．北京：中国农业大学，2008．

［2］乔支红，李艳芳，许荣华，等.豆腐酸浆老汤中产酸菌的分离筛选与鉴定［J］.食品工业科技，2015，36（3）：182-189.

［3］管立军，程永强，穆慧玲，等．乳酸菌发酵豆浆制作豆腐得率的研究［J］.食品科技，2009，34（3）：36-41.

［4］李里特．大豆加工与利用［M］．北京：化学出版社，2003：301-302.

［5］王国良．酸浆野生菌发酵黄浆水生产天然凝固剂的研究［D］．济南：山东轻工业学院，2005．

［6］Qiao Z H，Chen X D，Cheng Y Q，et al.Microbiological and chemical changes during the production of acidic whey，a traditional Chinese tofu-coagulant［J］.International Journal of Food Properties，2010，13（1）：90-104.

［7］赵贵丽，罗爱平，廖娅凡，等．酸浆最适自然发酵条件研究［J］．食品科学，2013，34（17）：201-204．

［8］于海峰，徐国华，郭英熙.酸浆中嗜酸乳杆菌发酵豆腐废水发酵条件的研究［J］.饲料工业，2010，31（7）：22-24.

［9］赵贵丽，罗爱平，廖娅凡，等．乳酸菌在大豆黄浆水中发酵条件的优化［J］.食品与机械，2014，30（2）：216-225.

［10］张刚.乳酸细菌—基础、技术和应用［M］．北京：化学工业出版社，2006：126-128，160-165．

Research on the standard technology of acid whey

QIAO Zhi-hong，YAN Jia，CHEN Hong，XU Rong-hua
（Tourism College，Beijing Union University，Beijing 100101，China）

Used five lactic acid bacteria which screened from the tofu acid whey to ferment tofu whey.The pH values of tofu whey were taken as the evaluating index.Some factors affecting the fermentation conditions of tofu whey such as single strains fermentation，mixed strains fermentation，fermentation temperature，inoculum size and proportion of mixture were discussed.On the basis of single factor experiment，the orthogonal experiment was designed.The results showed that the optimal conditions of acid whey fermentation were double strains fermentation，proportion of mixture 1∶9（No1 and No3），5%inoculum size，fermentation temperature 42℃，fermentation time 24 h.The pH value of tofu acid whey was 3.56.

tofu whey；acid whey；pure breeds fermentation；standard production technology

TS214.2

A

1002-0306（2015）12-0162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.025

2014－08－29

乔支红（1976-），女，博士，讲师，研究方向：中国传统大豆制品加工。

北京市教委科研计划（81106991425）。