超高效液相色谱-串联质谱法同时测定配方奶粉中泛酸、生物素和氰钴胺素

李菁菁，叶　润，崔亚娟，*，李全霞，李　东，路　勇，张卫民，黄　华，赵茜茜

（1.北京市营养源研究所，北京100069；2.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100041）

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定配方奶粉中泛酸、生物素和氰钴胺素

李菁菁1，叶润1，崔亚娟1，*，李全霞1，李东1，路勇2，张卫民2，黄华2，赵茜茜2

（1.北京市营养源研究所，北京100069；2.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100041）

建立了超高效液相色谱-串联质谱联用技术同时测定配方奶粉中泛酸、生物素和氰钴胺素的方法。样品经水溶超声提取、三氯甲烷除蛋白后，进行超高效液相色谱-串联质谱分析，采用HSS T3液相色谱柱分离，以10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾-正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析。结果表明：泛酸（VB5）的方法定量限为5μg/100g，生物素（VB7）为2μg/100g，氰钴胺素（VB12）为0.2μg/100g；回收率为79.4%～87.8%，相对标准偏差为3.3%～5.3%。泛酸的线性范围0.5～1000ng/mL，生物素为0.2～10ng/mL，氰钴胺素为0.02～10ng/mL。该方法分析操作简单、速度快、灵敏度高、重复性好，适用于配方奶粉中泛酸、生物素和氰钴胺素的同时测定。

泛酸，生物素，氰钴胺素，超高效液相色谱-串联质谱法，奶粉

泛酸（Pantothenic acid，VB5）、生物素（Biotin，VB7）、氰钴胺素（Cyanocobalamin，VB12）是配方奶粉中必须添加的维生素，对婴幼儿快速发育的各种组织和器官具有十分重要的作用［1］。其含量均较低，尤其是生物素和氰钴胺素含量通常以微克来表示。

目前，国家标准对配方奶粉中泛酸的检测方法是微生物法和高效液相色谱法［2］。其中，微生物法［3-5］是测定泛酸的经典方法，但是该方法复杂费时，并对环境条件要求高，影响因素多，且重复性稍差。国家标准对生物素、氰钴胺素的检测方法采用微生物法［6-7］，具有相类似的问题。高效液相色谱法［8-12］样品前处理复杂，且杂质峰干扰多，测定基质干扰大、灵敏度低，应用受到限制。国内外利用超高效液相色谱串联质谱法［13-17］同时测定泛酸、生物素、氰钴胺素单种或其中2种的相关研究已有报道。

本研究采用基质加标法，可以排除样品基质的干扰，保证了分析结果的准确性。采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）实现奶粉中泛酸、生物素、氰钴胺素的同时测定，是一种简单、快速、准确的分析方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

奶粉市售配方奶粉；泛酸（VB5，CAS：79-83-4）、生物素（VB7，CAS：58-85-5）、氰钴胺素（VB12，CAS：68-19-9）纯度均大于99.5%，美国IsoSciences公司；甲酸、乙酸铵（均为色谱纯） 美国Sigma公司；乙醇、乙腈、三氯甲烷（均为色谱纯） 美国Fisher公司；实验用水超纯水。

Acquity@UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪美国Waters公司；Acquity@HSS T3色谱柱美国Waters公司；高速冷冻离心机日本HITACHI公司；漩涡振荡器美国Scientific Industries公司；分析天平德国Sartorius公司。

1.2实验方法

1.2.1溶液配制混合标准工作液：精确称取泛酸钙、生物素、氰钴胺素标准品适量（精确至0.01mg）用水溶解，配制成100μg/mL的混合储备液，冷藏避光保存3个月。临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经0.22μm GHP滤膜过滤，进行UPLC-MS/MS分析。

1.2.2样品处理称取样品1.0g于50mL离心管中，加入10mL水。涡旋振荡1min，超声10min。加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP滤膜过滤后上机测定。

1.2.3基质加标实验提取前加标处理：称取样品1.0g于50mL离心管中，分别加入3个不同浓度的混合标准工作液，然后加入10mL水溶解。其后处理同1.2.2。

提取后加标处理：取1.2.2中的上清液1mL于10mL容量瓶中，分别加入3个不同浓度的混合标准工作液。

通过比较提取前加标样品峰面积（A前）和提取后加标样品峰面积（A后）得到回收率，扣除了基质效应，回收率计算公式如下：

1.2.4色谱条件液相系统：Acquity UPLC系统；色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱（1.0mm×100mm，1.8μm）；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）；流动相B：乙腈；梯度洗脱条件见表1。

1.2.5质谱条件质谱系统：Xevo TQ MS；离子化：ESI+；监测方式：多反应检测（MRM）；毛细管电压：2.3kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量（氮气）：50L/h；脱溶剂气流量（氮气）：1000L/h；碰撞气流速（氩气）：0.17mL/min。3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见表2。

表1　流动相梯度洗脱条件Table 1　Elution condition of the thirteen sedatives

表2　3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量Table 2　Confirmation and quantitative ions，cone voltages and collision energies of the three vitamins

2　结果与分析

2.1提取条件选择

针对泛酸、生物素、氰钴胺素既能溶于水，又能微溶于乙醇的性质，分别用水、10mmol/L乙酸铵和乙醇作为样品提取溶剂作为提取剂进行实验。结果表明：选择乙醇作为提取剂，可同时提取出奶粉中的其他有机物质，增加了基质的干扰；选择水和10mmol/L乙酸铵作为提取剂，灵敏度高、峰形稳定，效果最好。考虑到尽量简化提取操作的原则，选择水作为提取剂。

另外，针对奶粉样品中高蛋白的特性，分别考察了高氯酸和三氯甲烷的去除蛋白效果。结果表明，2种方式都可以使蛋白沉淀，获得澄清的样品溶液。但高氯酸对3种生物素的破坏性较大，处理后样品的响应值明显下降。而三氯甲烷对回收率无明显影响。因此选择三氯甲烷作为除蛋白剂。

2.2基质效应考察

基质是样品中除分析物以外的组分，对分析物的分析有显著干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应（ME）。LC-MS/MS中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用［18］。

实验采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应。基质效应（ME）=Set1/Set2，其中Set1：纯的标准品溶液信号峰面积值，Set2：样品基质提取后添加信号峰面积值。2个条件下重复测定5次。结果表明ME值均＜60%，奶粉样品中基质复杂，基质效应不可忽略。

2.3色谱条件选择

水溶性维生素通常很难在反相色谱柱上用常规的方法分离。本实验选用T3色谱柱，分别采用10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）和纯水、乙腈与甲醇作为流动相，以不同比例梯度进行洗脱。结果表明，流动相选用10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）和乙腈梯度洗脱，泛酸、生物素、氰钴胺素达到较好的分离效果，出峰时间分别为2.21、2.67、2.49min。

2.4质谱条件选择

使用UPLC-MS/MS方法，通过多反应监测（MRM）方式进行采集，选择目标物质的两对母离子/子离子，其中响应较强的离子对作为定量离子对，另一对作为定性离子对。3种维生素的MRM色谱图见图1。在电喷雾源正离子检测（ESI+）方式下，3种维生素的准分子离子峰为［M+H］+峰。实验调节各个参数得到响应较强的［M+H］+母离子峰。然后对母离子进行子离子扫描，调节碰撞能量。优化确定适合本实验条件的质谱条件，见表2。

图1　3种维生素的定量离子色谱图Fig.1　The quantification ion chromatogram of the three vitamins

2.5方法的验证

2.5.1回收率分别添加3个不同质量浓度（表3）标准溶液进行提取测定，泛酸、生物素、氰钴胺素的平均回收率分别为79.4%、84.8%、87.8%，RSD分别为4.4%、5.3%、3.3%。表明本法准确性较好，适合配方奶粉中3种维生素的定量分析。

表3　3种维生素添加回收实验结果（n=6）Table 3　Average recoveries and relative standard deviation of the three vitamins（n=6）

2.5.2线性范围、检出限和定量限取1.2.2中的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，进样分析。得到相关系数≥0.9985的较好线性关系，如图2所示，泛酸的线性范围0.5～1000ng/mL，生物素为0.2～10ng/mL，氰钴胺素为0.02～10ng/mL。

图2　3种维生素的校正曲线Fig.2　The calibration curve of the three vitamins

根据各定量离子3倍信噪比（S/N）对应样品中的浓度得到方法检出限，结果见表4。泛酸、生物素、氰钴胺素检出限分别为2、0.6、0.06μg/100g；以10倍信噪比（S/N）对应样品中的浓度得到方法定量限，泛酸、生物素、氰钴胺素定量限分别为5、2、0.2μg/100g。实验表明可以对3种维生素含量较低的样品进行定量分析。

表4　3种维生素的回归方程、检出限和定量限Table 4　Regression equations，limits of determination and limits of quantification of the three vitamins

2.5.3方法精密度取奶粉样品按照1.2.2中的方法处理，平行测定6次（n=6），考察方法的精密度，测定结果见表5。泛酸、生物素、氰钴胺素测定的相对标准偏差在3.1%～5.1%，表明该方法精密度较好，适用于奶粉中低含量的生物素、氰钴胺素的定量分析。

表5　3种维生素的测定结果Table 5　The result of determination of the three vitamins

3　结论

3.1以水溶解并超声提取配方奶粉中的水溶性维生素，并采用三氯甲烷除去提取液中蛋白，用0.22μm GHP滤膜过滤后进行测定。该操作简单，分析周期短，不需要复杂的前处理，得到了较好提取效果。

3.2通过基质加标法测定泛酸、生物素、氰钴胺素等三种维生素，样品回收率满足要求，表明该方法可用于同时测定上述3种物质的含量。本方法可替代使用价格昂贵的同位素内标法，降低中小企业的检验成本。

3.3建立了超高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，采用电喷雾-正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析，将检测时间控制在5min之内，大大提高了检测效率，值得推广。

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Determination of pantothenic acid，biotin，cyanocobalamine in formula milk powder using ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry

LI Jing-jing1，YE Run1，CUI Ya-juan1，*，LI Quan-xia1，LI Dong1，LU Yong2，ZHANG Wei-min2，HUANG Hua2，ZHAO Xi-xi2
（1.Beijing Research Institute for Nutritional Resources，Beijing 100069，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China）

Ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry（UPLC-TQMS）method had been developed for the determination for pantothenic acid（VB5），biotin（VB7），cyanocobalamine（VB12）in formula milk powder.The samples were ultrasonic extracted by water，and precipitated protein by chloroform for analyzing by UPLC-MSMS.The analytes were separated by HSS T3 column.The mobile phase consisted of 10mmol/L ammonium acetate with 0.1%formic acid and acetonitrile.The samples were identified and quantified by multiple reaction monitoring（MRM）via positive electrospray ionization（ESI+）.The results showed that the limit of quantification of VB5were 5μg/100g，VB7were 2μg/100g，VB12were 0.2μg/100g.The recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 79.4%～87.8%and 3.3%～5.3%，respectively.This method was simple，time saving，sensitive and accurate in the determination of VB5，VB7，VB12in formula milk powder.

pantothenic acid；biotin；cyanocobalamine；ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry；milk powder

TS207.3

A

1002-0306（2015）12-0061-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.004

2015－02－02

李菁菁（1985-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。

崔亚娟（1979-），女，硕士研究生，研究方向：分析与检测。

北京市科学技术研究院青年骨干计划（201315）；北京市科技计划（Z141100002614013）。