5株水貂阿留申病毒的分离与鉴定

刘东旭，时 坤，李健明，曾范利，刘 菲，杜 锐

（吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118）

5株水貂阿留申病毒的分离与鉴定

刘东旭，时 坤，李健明，曾范利，刘 菲，杜 锐

（吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118）

为给水貂阿留申病疫苗的研制奠定基础，对疑似感染阿留申病死亡的水貂内脏处理后，接种猫肾传代细胞（CRFK）分离病毒，并对分离的毒株进行PCR鉴定及动物回归试验。与此同时，首次应用免疫过氧化物酶单层细胞实验（IPMA）对所分离的水貂阿留申病毒进行TCID50的测定。结果成功分离并鉴定出5株水貂阿留申病毒株，分别命名为ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADV-QD2、ADV-QD3，各分离株的TCID50分别为105.7TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL。动物回归实验显示，所分离的病毒对水貂具有致病性，为水貂阿留申病毒强毒株。

水貂阿留申病毒；分离；鉴定；免疫过氧化物酶单层细胞试验

水貂阿留申病又称浆细胞增多症，是由阿留申病毒引起的水貂自身免疫系统紊乱性疾病。自1946年首次检测到该病以来，世界各地水貂养殖场陆续发现该病，并给水貂养殖业造成严重经济损失［1］。由于该病毒的致病机理比较特殊（形成抗原抗体复合物），迄今为止尚未研制出安全有效的预防制剂。因此水貂阿留申病疫苗的研制，一直是动物医学界很棘手的问题。

本实验对疑似感染阿留申病毒致死的水貂内脏进行研磨，通过猫肾传代细胞系（CRFK） 对病毒分离培养，并通过PCR和动物回归实验对所分离出的病毒进行鉴定，以便为深入研究水貂阿留申病毒奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物、菌种、质粒和细胞。PCR克隆载体pMD18-T与感受态细胞JM109，购自TaKaRa公司。猫肾传代细胞（CRFK），购自中国科学院上海细胞库。水貂阿留申病阴性水貂，购自黑龙江帽儿山水貂养殖场。

1.1.2主要试剂。UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒，购于上海生物工程技术服务有限公司；蛋白酶K、DNA分子量标准DL2000、Ex Taq酶、dNTP，购于大连宝生物工程公司；DNA凝胶回收试剂盒、溴化乙啶（EB）、琼脂糖、琼脂粉，购于维特洁公司；MEM液体培养基、胎牛血清，购于Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1病料的采集及处理。2012年11月，从黑龙江、吉林、辽宁和山东等地的数十家水貂养殖场，采集疑似感染阿留申病死亡的水貂内脏372份。对采集的内脏，加入MEM液体培养基后研磨和离心，收集上清。经0. 22 μm的滤膜过滤后，-40℃保存，用于病毒细胞培养。

1.2.2病毒分离及TCID50的测定。按常规细胞传代方法，对所有采集的病料进行病毒分离［2］。取1 mL处理后的病料上清，接种长满单层的CRFK细胞，吸附2～6 h后，再加入9 mL的维持液，在31.7 ℃、5% CO2的条件下，培养5～6天，反复冻融3次，收获培养物重新接种细胞，进行病毒盲传。三代后，-70℃低温保存。应用免疫过氧化物酶实验对所分离的病毒进行鉴定和TCID50的测定。CRFK细胞长满单层后，消化并接种于96孔板中，与此同时，将分离的病毒从10-1开始做10倍连续稀释，接种于96孔板中。待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS（PH7.2，100 μL/孔）洗涤一次后，用无水乙醇（含3%双氧水）4℃固定45 min。再用PBS洗涤三次后，每孔加入50 μL水貂阿留申病阳性血清（1:100倍稀释），37℃孵育1 h。弃去板中液体，三次洗涤后，每孔加入50 μL HPR标记的兔抗IgG（Sangon，1：4 000倍稀释），37 ℃孵育1 h。洗涤后，每孔加入新鲜配置的DAB液200 μL，在避光处显色5 min。弃去上清，用蒸馏水洗涤后，每孔加入Harris-苏木素液200 μL复染2 min。纯水洗涤5 min后，显微镜下观察结果。

1.2.3病毒电镜观察。将CRFK细胞第9代细胞培养物反复冻融3次后，3 000 r/min 离心20 min，取上清液，经2%磷钨酸负染后，进行电镜观察。

1.2.4病毒PCR鉴定及序列分析。应用UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒，按照说明书提取病毒DNA。根据Qie等［3］1996年设计的一对ADV特异性引物对所分离的毒株进行PCR鉴定，扩增693 bp的目的片段，引物序列如下：上游P1：5'-CTTGTCACGCTACTAGAATGGT 3'，下游P2：5'-AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT 3'。反应体系为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性0.5 min，50 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸l min，40个循环。循环结束后72 ℃继续延伸7 min，最后置4 ℃保存。PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接并转化至JM109感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，选取阳性克隆进行鉴定及测序。

1.2.5动物回归实验。将18只120日龄非免疫健康水貂（经多次对流免疫电泳检测为阴性）随机分成6组，每组3只，第1～5组水貂每只腹腔接种细胞培养分离的病毒液3 mL（104.0TCID50/mL），第6组每只腹腔接种3 mL生理盐水，做为空白对照。接种后隔离饲养，每天观察临床症状，检查其体温、呼吸、精神、食欲与粪尿等情况，连续观察60天。

2　结果

2.1病毒的TCID50的测定

将病貂内脏研磨接种CRFK细胞后，应用免疫过氧化物酶单层细胞实验进行鉴定。显微镜下观察可见，接种病毒的细胞特定部位被染成棕色或棕黄色，细胞边界清楚、结构清晰（图1a）。而阴性对照染色淡且无规律（不是在细胞的特定位置或存在于细胞间隙，见图1b）。本实验选取可传至第9代的5株分离病毒，测得细胞培养物的病毒含量分别为：105.7TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.6TCID50/ mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL，并分别命名为ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADVQD2、ADV-QD3。

图1a 接种病毒后的细胞染色结果

图1b 正常细胞染色结果

2.2病毒电镜观察结果

对分离的病毒进行电镜观察，可见病毒呈倒六边形、无囊膜，大小在20～26 nm的病毒样粒子（图2）。

图2　 ADV-DA125分离病毒电镜观察结果

2.3病毒的PCR鉴定及序列分析

以提取的病毒DNA为模板，根据GenBank上ADV-U株基因序列设计的引物进行PCR扩增，得到693 bp片段（图3），与预期结果相符，进一步证实了所分离的病毒为ADV。

图3　 PCR检测结果

将PCR扩增片段进行测序，分析分离毒株与标准对照毒株ADV-G相应片段的核酸同源性分别为98.8 %、94.7 %、92.8 %、94.1 %和93.5 %，与强毒参考株ADV-Utah的同源性分别为94.4 %、98.3 %、96.7 %、95.1 %和94.8 %（图4）。由于该扩增片段包含约40个核苷酸的超变区，此同源性足以说明扩增产物具有良好的特异性，确定为ADV 的DNA特异性片段。

图4　 5株分离株PCR扩增产物与标准毒株相对应基因片段的同源性分析

2.4水貂攻毒发病实验

将5株分离病毒，分别腹腔接种第1～5组水貂，3 mL/只，第6组腹腔接种等量的生理盐水，连续隔离观察60天。接种病毒组水貂均表现出消瘦、皮毛无光泽、拒食、狂饮，有些表现抽搐、痉挛、步态蹒跚、共济失调等神经症状（图5-1）。其中ADV-DL124、ADV-DL125两接种组发病较为明显，表现为：前期暴躁，后精神沉郁，随即出现抽搐、痉挛等症状。5个病毒接种组发病率均为100%。对照组均饮食正常，健康状况良好（图5-2）。对接种病毒的水貂解剖后观察组织器官病变，可见肾、肝、脾、淋巴结肿大出血，胃肠道出血（图5-3），对流免疫电泳检测及PCR鉴定结果均为阳性。对照组无明显病变说明所分离的病毒对水貂具有致病性，为水貂阿留申病毒强毒株。

图5　-1 水貂阿留申病发病水貂

图5　-2 健康水貂

图 5-3 水貂阿留申病发病水貂内脏

3　讨论

水貂阿留申病毒从强致病力毒株ADV-U到ADV-K、ADV-Pullman、ADV TR、ADV SL3等不同地区的分离毒株，在宿主的选择和致病力等方面，均存在一定的差异（Gottschalck E等和Aasted B等）［4-5］。ADV-G是ADV-U适应体外细胞培养后失去致病力的实验室株，可以在细胞内任意复制（Van Dawen S等）［6］，但对成年水貂无致病性。ADV-SL3是唯一的既易于在体外培养又具有致病力的毒株（Bloom ME等）［7］，其它强毒株的体外细胞培养复制能力都较弱。目前细胞培养方法仍是水貂阿留申病毒分离、鉴定的最常用方法，但往往由于阿留申病毒在传代细胞上不产生或产生不明显的CPE，致使给病毒TCID50的测定带来一定的困难。

IPMA 是通过将标记酶的抗体（抗原）与抗原（抗体）相结合，形成酶标抗体-抗原复合物。复合物上的酶，在遇到相应的底物时催化底物分解，使供氢体被氧化而生成有色物质（韦选民等）［8］。该方法具有特异强、敏感高、操作简便等特点，并在猪圆环病毒的检测中已得到应用（刘长明等和郭全海等）［9-10］。基于猪圆环病毒与水貂阿留申病毒相似，同样不产生CPE，因此本实验尝试应用IPMA对所分离的水貂阿留申病毒进行检测及TCID50的测定，为该病毒的生物学特性研究提供了可行的技术方法。

研究表明，水貂阿留申病细胞灭活疫苗具有一定的免疫保护效果，但由于ADV感染水貂后，水貂体内不产生或只产生少量的中和抗体，而产生的多数抗体不仅不能中和病毒的毒力，反而通过介导抗体依赖性增强作用，有助于ADV对靶细胞的侵染。再有，病毒抗原与抗体形成的复合物（Immune Complex，IC）可导致IC沉积并引发肾小球肾炎和动脉炎。正是由于水貂阿留申病这种复杂的致病机理和免疫机理，迄今为止尚未开发出有效防治水貂阿留申病的疫苗。本实验对疑似水貂阿留申病死亡病貂内脏处理后接种CRFK细胞分离病毒，并对分离的毒株进行PCR鉴定及动物回归试验，成功分离并鉴定出5株ADV毒株，为水貂阿留申病疫苗的研制奠定了基础。

［1］ Farid A H，Rupasinghe P，Mitchell J L，et al. A survey of Aleutian mink disease virus infection of feral American mink in Nova Scotia［J］. Vet J，2010，51：75-77.

［2］ 梁冬莹. ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用［D］. 哈尔滨：东北林业大学，2007年.

［3］ Oie K，Durrant G，Wolfinbarger J B，et al. The relationship between capsid protein （VP2） and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：a possible role for in the transmission of ADV infections［J］.Virol，1996，70（2）：852-861.

［4］ Gottschalck E，Alexandersen S，Cohn A，et a1.Nucleofidesequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink［J］. J Viro1，1991，65（8）：4378-4386.

［5］ Aasted B，Avery B，Cohn A. Serological analyses of different mink Aleutian disease virus strain［J］. Arch Viro1，1984，80（1）：11-22.

［6］ Van Dawen S，Kaaden O R，Both S. Propagation of Aleutian disease parvovirus in cell line CCC clone 81［J］. Arch Viro1，1983，77（1）：39-50.

［7］ Bloom M E，Alexandersen S，Perryman S，et al. Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：Sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV［J］. J Virol，1988，62（8）：2903-2915.

［8］韦选民，任蕊萍.动物疾病实验室检验手册［M］. 1版. 北京：中国农业出版社，2006：104.

［9］刘长明，张超范，危艳武，等. 猪圆环病毒2 型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用［J］. 中国预防兽医学报，2007，29（8）：621-633.

［10］郭全海，刘秀玲. 免疫过氧化物酶单层细胞试验检测猪圆环病毒2 型方法的建立［J］. 黑龙江畜牧兽医，2012，6（11）：122-123.

（责任编辑：朱迪国）

Isolation and Identif cation of Five Strains of Aleutian DiseaseViruses in Mink

Liu Dongxu，Shi Kun，Li Jianming，Zeng Fanli，Liu Fei，Du Rui
（College of Chinese Medicine Material，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118）

In order to lay foundation for the development of Aleutian disease vaccine，the CRFK cells were used to isolate the ADV with viscera samples collected from the dead minks which was suspected ADV infection sampled. The isolated strains were identified by PCR and regression experiments on animal. At the same time，Immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）was used to detect the median tissue culture infective doses（TCID50）of isolated strains in the first time. Five strains of ADV（ADV-DL124，ADV-DL125，ADV-ZJ3，ADV-QD2，ADV-QD3）were isolated whose TCID50 were 105.7 TCID50/mL，105.0 TCID50/mL，104.6 TCID50/mL，105.2 TCID50/mL，and 104.1 TCID50/mL，respectively. These results of regression experiments on animal indicated that the isolated virus were the virulent strains of AD virus.

ADV；isolation；identification；IPMA

S851.3

A

1005-944X（2015）12-0073-05

杜 锐