黑龙江省一株马流感病毒的全基因组测序及同源性分析

赵 钊，郭 巍，关平原，王晓钧，吕 洋，安 茹

（1. 内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；3.北京市延庆县农业局，北京延庆 102100 ）

黑龙江省一株马流感病毒的全基因组测序及同源性分析

赵 钊1，2，郭 巍2，关平原1，王晓钧2，吕 洋3，安 茹3

（1. 内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；3.北京市延庆县农业局，北京延庆 102100 ）

通过采集一匹患病马的病料及后续的病毒分离、病毒核酸提取、RT-PCR、连接T载体等一系列分子生物学技术，对病毒核酸进行测序，经NCBI比对分析，获得一株H3N8亚型马流感病毒。将获得的毒株与我国分离的A/equine/Jilin/1/1989禽源性毒株、2002年美国肯塔基分离株A/equine/Kentucky/1/02（美洲谱系Florida亚型）、A/equine/Argentine/77（美洲谱系Argentine亚型）等有代表性毒株进行同源性分析，发现该毒株与Florida-2型马流感病毒基因片段的同源率最高。根据马流感病毒的命名规则，将这毒株命名为A/equine/Heilongjiang/1/2010。本次所分离到的黑龙江株马流感病毒，丰富了我国马流感病毒资源库，为我国马流感流行病学研究、诊断技术及疫苗研究提供了重要基础。

马流感病毒；基因组；同源性；分子生物学技术

马流感（Equine infl uenza，EI）是由马流感病毒（Equine infl uenza virus，EIV）所引起的一种急性传染病。EIV是正粘病毒属A型流感病毒，历史上共出现过两个亚型：H7N7和H3N8。然而近年鲜有H7N7亚型感染的报道［1］，世界动物卫生组织（OIE）认为这种亚型毒株为不流行毒株，或者是呈亚临床流行状态。近年来，马流感呈全球性流行的趋势，全球仅新西兰和冰岛无马流感疫情报告［2］，我国历史上曾发生过四次大流行［3］。随着赛马业在我国的快速发展，马流感防控更显重要。一旦暴发马流感，将会对马养殖业、赛马业等相关产业造成巨大的经济损失［4］。

2010年，黑龙江省发现一例马流感疑似病例。实验室人员对患马进行了隔离，并采患马的鼻咽拭子样品进行病毒分离与培养及全基因组的测序分析和同源性分析，确定了病毒来源。本次研究掌握了我国马流感目前的流行毒株，对于马流感的预防及后续疫苗的研发奠定了基础。

1　材料和方法

1.1主要实验动物、试剂

感受态细胞DH5α购自大连宝生物公司；EIV毒株A/equine/Jilin/1/1989由本实验室保存；本实验所使用SPF鸡胚、SPF鸡血由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

青霉素、链霉素购自Hyclone公司；病毒RNA 小量提取试剂盒购自Qiagen公司；DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Ex Taq PCR扩增酶、pMD19-T Simple载体均购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2发病马的临床诊断及病料采集

通过对疑似马流感患马进行临床诊断后，将发病马匹站立保定，用棉拭子经前侧鼻道伸入鼻咽部，沾取呼吸道粘液。在鼻咽部不同位置共采集样品5个，保存于含40%甘油的磷酸盐缓冲液中，每管约含4～5 mL缓冲液，4 ℃冰盒保存，迅速运至实验室。

1.3病毒分离

在保存拭子的培养液中加入双抗（青霉素1 000单位/mL，链霉素1 000 μg/mL），4℃作用2 h，充分挤压拭子后取保存液，置于离心机以2 000 r/min离心15 min，取上清液经尿囊腔接种于9 日龄SPF鸡胚。每个样品接种6 个鸡胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育，废弃接种后24 h内死亡的鸡胚。此后每12 h观察1 次，取出死胚。经72 h后，无菌收取所有24 h后死亡的鸡胚尿囊液。利用上述方式继续培养三代传至第四代，将3个样品的尿囊液经HA 试验，选取HA效价最高的尿囊液保存于-80 ℃，取部分尿囊液进行电镜观察。

1.4红细胞凝集（HA）试验

采新鲜SPF鸡血制备0.5 %鸡红细胞悬液，在V形底的96孔血凝板中每排的2到12 孔分别加入50 μL的PBS （pH7.2）。在每排的第一孔加入100 μL病毒尿囊液。在最后一排每孔加50 μL PBS，为红细胞对照孔。做倍比稀释：从第一孔转移50 μL至下一孔，最后的50 μL弃去。然后加50 μL红细胞悬液至每一孔，室温孵育30 min，确定对照成立后，判读结果。

1.5病毒RNA的提取

使用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。使用马流感各片段通用引物进行扩增。使用M-MLV做反转录，uni-12为特异性引物（5'ATCAAAAGCAGG），使用ExTaq做PCR（各基因片段PCR引物及扩增条件见表1），所有扩增都进行30个循环。PCR完成后，将产物纯化，插入pMD19-T Simple载体，送英俊生物工程有限公司测序。

表1　各基因片段PCR引物及PCR扩增条件

1.6 同源性分析

使用DNAStar软件，将本次分离病毒的HA、NA片段分别与1989 年吉林省分离株A/equine/ Jilin/1/1989（禽源毒株）、2002年美国肯塔基分离株A/equine/Kentucky/1/02（美洲谱系Florida亚型）、A/equine/Argentine/77（美洲谱系Argentine亚型）的相对应基因进行同源性分析。

2　结果

2.1临床诊断

发病马表现为精神不振、虚弱无力、头下垂、食欲减少、结膜潮红、流泪、体温40℃，经常干咳，鼻流黏性脓性分泌物，均为典型的流感症状。

2.2病毒分离培养及HA试验

将保存有鼻咽拭子的3个保存液预处理后，接种SPF鸡胚，盲传4代，经HA试验，并设置阳性对照组。结果如图1所示，阳性对照、阴性对照均正常，样品结果可靠，且都有HA价，分别为24、25、26。

图1　 HA试验结果

2.3电镜观察

选取效价为26的尿囊液分离物，用电子显微镜负染色观察，发现典型的大小为100 nm左右的椭圆形流感病毒颗粒（图2） 。

2.4病毒各基因片段扩增及测序结果

提取尿囊液中病毒RNA，进行RT-PCR扩增后测序（图3），得到的8个基因片段的长度分别为：PB2（2280 bp）、PB1（2274 bp）、PA（2151 bp）、HA（1704 bp）、NP（1497 bp）、NA（1413 bp）、M（982 bp）、NS（838 bp）。各片段的基因信息已经上传NCBI，登记号为AGR45341～AGR45351。

图2　 马流感病毒电镜负染图

图3　病毒各基因片段的RT-PCR扩增

2.5同源性分析

将本次实验分离的病毒序列与各个流行株，包括禽源性（A/equine/Jilin/1/1989）及最近流行株Florida-2（A/equine/Kentucky/1/02）等进行比较，发现本次分离发现的毒株与Florida-2型（A/ equine/Kentucky/1/02）同源率最高（表2）。根据流感病毒的命名规则，我们将此次发现的病毒命名为A/equine/Heilongjiang/1/2010。

表2　HA、NA 基因同源性分析

3 讨论

通过对本次发病马匹上分离到的病毒进行全基因组测序，我们发现了一株Florida-2型的H3N8亚型EIV。通过将A/equine/Heilongjiang/1/2010病 毒的HA基 因 与Florida-2型（A/equine/Kentucky/1/02）的HA基因相比较，发现黑龙江株的ORF部分核苷酸发生了突变，但均为同义突变，并不会导致抗原性氨基酸的变异。

到目前为止，马流感仅有H7N7和H3N8两种亚型。早期的H7N7亚型于1956年由Sovi-nova等在布拉格分离得到，命名为A/马/1/布拉格/1/56（我国原称为马甲1型），H3N8亚型于1963年由Waddell等在迈阿密分离得到，命名为A/马/2/迈阿密/1/63（我国原称为马甲2型），是目前的流行株。H3N8亚型于二十世纪80年代分化为两个谱系，根据其最初的地理位置分为美洲谱系和欧洲谱系［6］。美洲谱系中有三种亚型频繁出现［7］，包括Florida亚型、Argentina亚型和Kentucky亚型，其中Florida亚型是目前我国的主要流行株，其自身也分为两种不同的抗原类型：1型与2型。

对于马流感的预防，目前国际上主要采用接种疫苗的手段。目前使用的包括正在研制的疫苗主要是全价灭活疫苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗和DNA疫苗。灭活苗由于其抗原成分齐全，免疫原性强，且安全性好，不会有毒力返强和变异的危险，一直很受欢迎；目前的亚单位疫苗主要是利用分子生物学手段，表达EIV的HA和NA蛋白，使机体产生抗体，经亚单位疫苗免疫接种的马，可产生特异性的IgGa和IgGb，比全毒灭活疫苗效果更好［8］；减毒活疫苗由于保留了病毒原有的部分活性，可通过自然途径感染机体并在体内复制，可激发长期而有效的免疫应答［9］；接种DNA疫苗后，马机体内可产生特异性的IgGa、IgGb和IgA，同时特异性淋巴细胞增生、γ-IFN的合成增加［10-12］。由于我国目前还无马流感疫苗，本实验室正在研制，因此必须要了解国内马流感目前的流行株，从而使疫苗具有更好的针对性。此次黑龙江株病毒的发现，说明国内已经传入Florida-2型病毒，也提醒我国要预防此种毒株在国内的大规模流行，并且对疫苗的研制有一定的指向作用。

［1］ Webster R. Are equine I influenza viruses still present in horse［J］. Equine Vet，1993，25 （6）：537-538.

［2］ OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals［M］. Paris：OIE，2012.

［3］ 杨建德，相文华，薛飞，等. 我国马流感的研究现状［J］. 黑龙江畜牧兽医，2002（3）：3.

［3］ Lewis N S，Daly J M. Antigenic and Genetic Evolution of Equine Influenza A （H3N8） Virus from 1968 to 2007 ［J］. Journal of Virology，2011（23）：12742-12749.

［5］ Zhu C，Li Q，Guo W，et al. Complete Genomic Sequences of an H3N8 Equine Influenza Virus Strain Isolated in China ［J］. Genome Announcements，2013（4）：1.

［6］ Daly J M，Lai A C，Binns M M. Antigenic and genetic evolution of equine H3N8 influenza A viruses ［J］. J Gen Virol，1996，77（4）：661-671.

［7］ Lai A C K，Chambers T M，Holland R J，et al. Diverged evolution of recent equine-2 influenza （H3N8） viruses in the Western Hemisphere ［J］. Arch Virol，2001，146（6）：1063-1074.

［8］ Daly J M，Newton J R. Current perspectives on control of equine influenza ［J］. Vet Res，2004，35（4）：411-423.

［9］ Quinlivan M，Zamarin D，Garcia-Sastre A. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein［J］. J Virol，2005，79（13）：8431-8439.

［10］ Toulemonde E C，Daly J M，Sindle T，et al. Efficacy of a recombinant equine influenza vaccine against challenge with an American lineage H3N8 influenza virus responsible for the 2003 outbreak in the United Kingdom［J］. Vet Rec，2005，156（12）：367-371.

［11］ Paillot R，Kydd J H，Sindle T，et al. Antibody and IFN-gamma responses induced by a recombinant canary pox vaccine and challenge infection with equine influenza virus ［J］. Vet Immunol and Immunopathol，2006，112（3/4）：225-233.

［12］ Breathnacha C C，Clarka H J，Clarka R C，et al. Immunization with recombinant modified vaccinia Ankara （rMVA）constructs encoding the HA or NP gene protects ponies from equine influenza virus challenge［J］. Vaccine，2006，24（8）：1180-1190.

（责任编辑：胡藕祥）

Whole Genome Sequencing and Homology Analysis of An Equine Inf uenza Virus Strain in Heilongjiang Province

Zhao Zhao1，2，Guo Wei2，Guan Pingyuan1，Wang Xiaojun2，Lű Yang3，An Ru3
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. Harbin Veterinary Research Institute，CAAS，Harbin，Heilongjiang 150001；3.Yanqing Agricultural Bureau of Beijing，Yanqing，Beijing 102100）

Through the collection of pathological specimen from a diseased horse and subsequent virus isolation，virus nucleic acid extraction，RT-PCR and a series of molecular biology techniques，ultimately the virus nucleic acid was sequenced. The H3N8 subtype of equine influenza virus was obtained by sequencing and NCBI comparison analysis. The strain was compared with A/equine/Jilin/1/1989，A/equine/Kentucky/1/02（Florida subtype）and A/equine/Argentine/77（Argentine subtype），and the highest homology was found between the strain and the Florida-2subtype.According to the nomenclature of the equine influenza virus，the virus was named A/equine/Heilongjiang/1/2010. The Heilongjiang strain of equine influenza virus isolated from this research enriched the resource base of the influenza virus in China. It also provided an important basis for the study of equine influenza epidemiology in the country.

equine influenza virus；genome；homology；molecular biology technique

S852.65+2

A

1005-944X（2015）12-0069-04

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012BAD46B03）

关平原