改良多平台法建立大鼠部分睡眠剥夺模型及其效果评价＊

何玉宏，王培欢，吴高义，孙志卫，席兰兰

基础医学

改良多平台法建立大鼠部分睡眠剥夺模型及其效果评价＊

何玉宏，王培欢，吴高义，孙志卫，席兰兰

目的利用改良多平台法建立一种大鼠部分睡眠剥夺模型，并对该模型进行评价。方法将50只大鼠随机分为正常对照组、大平台对照组、睡眠剥夺1天组、5天组、9天组，共五组，并采用改良后的多平台方法建立相应的模型体系；观察睡眠剥夺各时间段大鼠行为学变化以及睡眠剥夺后血清促肾上腺皮质激素（CORT）、皮质醇（ACTH）、促甲状腺激素（TSH）含量的变化。结果睡眠剥夺组大鼠行为学发生巨大改变，旷场试验中在垂直活动得分以及水平活动得分中NC组和TC组差异无统计学意义，睡眠剥夺1天以及睡眠剥夺5天组垂直活动得分和水平活动得分均高于正常对照组和大平台对照组，而睡眠剥夺9天组两方面得分均低于正常对照组和大平台对照组，且均有统计学差异。与正常对照组和大平台对照组相比，随着睡眠剥夺时间的延长大鼠血清中促肾上腺皮质激素（CORT）、皮质醇（ACTH）、促甲状腺激素（TSH）的含量均呈现先增高后降低的趋势。结论利用改良多平台方法建立相应的大鼠睡眠剥夺模型体系，具有良好的睡眠剥夺模拟效果，可以用来进行睡眠障碍实验的研究。

睡眠剥夺；旷场试验；改良多平台法

睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）是研究睡眠的功能和发生机制的重要方法之一［1］，睡眠剥夺模型的可靠性及准确性直接影响睡眠剥夺实验结果。根据睡眠过程中脑电图表现、肌肉张力的变化及眼球运动状况，可以将睡眠过程分为快动眼睡眠（rapid eye movement，REM）非快动眼睡眠（non rapid eye movements，NREM）两种不同的时相，在正常情况下，两者有规律地交替循环进行，快动眼睡眠主要用于恢复脑力，而非快动眼睡眠主要用于恢复体力。在人类因各种因素所导致的睡眠障碍中，很少有完全的睡眠剥夺，一般为部分睡眠剥夺，而被剥夺的部分正是睡眠时相中的快动眼睡眠时相。基于这种情况，笔者通过改良多平台睡眠剥夺法［2］（MMPM）建立大鼠睡眠剥夺的模型，最大限度地模拟人类睡眠障碍。睡眠剥夺是一种典型的内源性氧化应激模型［3］，对睡眠剥夺动物模型的评价可以采用一般心理应激模型的评价方法。由于动物无法明确表达其精神心理状态，到目前为止尚没有一个公认的用于评价动物精神心理异常的标准。本实验旨在通过建立大鼠睡眠剥夺模型，通过检测大鼠在睡眠剥夺不同时期行为学及血清学指标的变化，初步睡眠剥夺动物模型的建立方法及评价标准。

1　材料与方法

1.1动物及仪器试剂

1.1.1实验动物成年Wistar大鼠，雄性，共50只，体重（200±15）g，清洁级，经检查所有实验大鼠身体状况良好，口颌系统形态结构及功能正常无全身性疾病，动物及饲料由山东大学动物实验中心提供。

1.1.2主要试剂和仪器10%水合氯醛（30ml，济南军区总医院药剂科，济南）；电子天平（JA2603B，上海精密仪器仪表有限公司，上海）；离心机（Key Wite-D，Thermo Electron Corporation，USA）；全自动免疫发光分析仪（IMMULITE 2000，SIEMENS，Germany）；全自动微粒子化学发光仪（UniCel DxI800 Access，Beckman Coulter，USA）；大鼠睡眠剥夺箱（自制）；旷场试验箱（自制）。

1.2实验方法

1.2.1动物分组和处理将50只大鼠进行随机分组，使之分成正常对照组（NC）、大平台对照组（TC）、睡眠剥夺1天组、5天组、9天组，共五组，各组在对应时间点进行观察，并进行旷场试验，然后腹腔注射麻醉下行心脏取血。睡眠剥夺9天组心脏取血后再对正常对照组和大平台对照组进行处理。

1.2.2模型建立与方法［2］采用MMPM法建立大鼠睡眠剥夺模型，利用厚80mm的玻璃制作110 cm× 70 cm×45 cm的玻璃睡眠剥夺箱，箱内放置15个高8 cm，直径6.3 cm金属小平台，平台之间相距15 cm。实验中，箱内注水深度7 cm，水温度保持22℃左右，玻璃睡眠剥夺箱上面置网盖，网盖上放置饲料及饮水瓶，大鼠可自由摄食摄水，当其进入睡眠状态时，身体肌张力降低后头部触水，惊醒。大平台采用1个长105 cm、宽65 cm的长方形钢丝网板，置于小平台上组建一个大的网格平台，网格由相互间隔2.0 cm的不锈钢条组成，可以避免大鼠落入水中，其余条件与小平台组条件一致，正常对照组单笼饲养。昼夜光照、室内温度和饲养条件各组相同。

1.2.3旷场试验［4］制作长宽各为100 cm，高为50 cm的方箱，四周壁为复合板制作而成，底壁为涂有黑色的板材制成，底面分成25个20 cm×20 cm的方格。在实验过程中，把单个大鼠放置在旷场试验箱的正中央方格中，2名实验人员对于大鼠在五分钟之内的各种行为进行观察并分别记录。垂直活动得分（rearing score）以大鼠两个前脚离开平面的时候为标志，到放下双脚的时候记做1分，站立时间不做统计；水平活动得分（crossing score）以大鼠跨越一个方格记1分。旷场试验得分为两者之和。一只大鼠测完后，利用75%乙醇对旷场箱进行清洁并充分晾干后，再观察下一只大鼠，避免因为气味而对结果产生不良影响。

1.2.4大鼠血清ACTH、CORT及TSH含量的测定

各实验组大鼠在相应时间点集中处理，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小动物实验台固定，75%乙醇胸部皮肤局部消毒后，取5ml一次性注射器，于大鼠胸骨剑突下缘正中处30°角斜穿刺入心脏，缓慢抽拉并调整进针深度至血液轻松抽出，取血约5ml，轻柔注入5ml消毒EP管内，垂直放置15min后离心机离心10min，3000 r/min，抽取上清液至2ml EP管内，即刻置于-20℃冰箱冻存。集中血清样本后分别测量ACTH、CORT及TSH的含量。

1.3统计学分析实验数据利用SPSS15.0统计软件处理，采用单因素方差分析（one－way ANOVA）进行检验，检验水准设定α=0.05。

2　结果

2.1大鼠基本情况大鼠睡眠剥夺1 d时，其活动增多，兴奋性明显提高（图1-a）；睡眠剥夺5 d时，大鼠表现出容易激惹状态，刺激后易怒，相互之间有明显的攻击行为（图1-b）；睡眠剥夺达9 d时，大鼠表现为活动能力的降低，对外界刺激反应淡漠，精神不振，呼吸频率加快，甚至进食时达到睡眠状态，呈现出身体极度疲弱、精神萎靡的状态（图1-c）。大平台对照组（图1-d）及正常对照组大鼠则能够正常的摄食和饮水，体重及体质较实验前均有增加，对外界刺激反应准确灵敏。

2.2旷场试验NC组和TC组在水平活动得分和垂直活动得分虽略有差异，但无统计学意义；SD 1天组两方面得分均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；SD 5天组得分明显高于两对照组，且差异具有明显的统计学意义（P＜0.01）；而SD 9天组得分情况均低于对照组，且差异也具有明显的统计学意义（P＜0.01）。各实验组水平得分和垂直得分情况见表1，水平得分及垂直得分大致变化如图2，水平得分和垂直得分出现先升高后降低趋势。

图1　大鼠基本情况

表1　实验各阶段大鼠旷场试验评分情况（±s）

表1　实验各阶段大鼠旷场试验评分情况（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与大平台对照组比较，#P＜0.05；与正常对照组及大平台对照组比较，＊P＜0.01

正常对照组大平台对照组SD 1 d组SD 5 d组SD 9 d组水平得分52.13±8.16 53.49±9.21 61.17±6.43△#108.26±9.45＊21.13±5.28＊垂直得分24.21±3.52 22.62±3.15 29.11±3.21△#33.86±4.12＊9.13±2.31＊

2.3血清学指标

2.3.1大鼠血清ACTH含量正常对照组和大平台对照组血清中促肾上腺皮质激素（ACTH）含量无明显差别，SD 1天组与两对照组相比ACTH含量有一定的升高但差异无统计学意义（P＞0.05）；SD 5天组ACTH含量升高，明显高于两对照组（P＜0.05）；SD 9天组ACTH含量出现降低，并且远低于两对照组，差异也具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。由实验组血清内ACTH含量线状图（图3）可见，大鼠血清ACTH含量随着睡眠剥夺时间的延长呈现先升高后降低的趋势。

图2　实验各阶段大鼠旷场试验评分情况

表2　不同睡眠剥夺时间后大鼠血清ACTH、CORT和TSH含量（±s）

表2　不同睡眠剥夺时间后大鼠血清ACTH、CORT和TSH含量（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与大平台对照组比较，#P＜0.05；与正常对照组及大平台对照组比较，＊P＜0.01

组别ACTH（pg/mL）CORT（μg/dL）TSH（μIU/ml）NC 312±36 0.79±0.12 0.21±0.08 TC 321±32 0.81±0.14 0.22±0.10 SD 1 d 357±35 1.22±0.19△#0.38±0.09△#SD 5 d 427±40△#1.78±0.17＊0.82±0.11＊SD 9 d 257±39△#0.89±0.15 0.53±0.07＊

2.3.2大鼠血清CORT含量大平台对照组CORT含量略高于正常对照组但差别不具有统计学意义。睡眠剥夺1 d后，大鼠血清CORT含量迅速升高，与两对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；SD 5 d组血清CORT含量继续升高，最终超过两对照组的1倍，差异具有明显的统计学意义（P＜0.01）；至睡眠剥夺9 d时CORT含量较5 d时含量明显下降，约为5 d组的1/2水平，与对照组持平，与两对照组比较无明显差异（P＞0.05）（表2）。血清内ACTH含量变化图（图4）可见，大鼠血清CORT含量随着睡眠剥夺时间的延长亦呈现先升高后降低的趋势。

图3　不同睡眠剥夺时间后大鼠血清ACTH含量

图4　不同睡眠剥夺时间后大鼠血清CORT含量

2.3.3大鼠血清TSH含量正常对照组与大平台对照组TSH含量虽略有差异（相差仅0.01μIU/ ml），但无统计学意义（P＞0.05），大鼠睡眠剥夺1 d后，血清TSH含量即出现明显升高，与正常对照组和大平台对照组相比增加近1倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；至SD 5 d时，TSH含量急剧升高，远高于对照组（约为对照组4倍），有明显统计学差异（P＜0.01）；然而，随睡眠剥夺时间的延长，至SD 9 d时TSH含量虽有明显下降，但仍均高于正常对照组和大平台对照组（高出超过1倍），差异具有明显统计学意义（P＜0.01）（表2）。随着睡眠剥夺时间的延长，大鼠血清TSH含量变化呈先升高后降低的趋势（图5）。

图5　不同睡眠剥夺时间后大鼠血清TSH含量

3　讨论

睡眠约占人们生命的1/3，是生物机体的本能行为之一，对于维持种族延续和个体生存具有重要的意义。另外，睡眠也是一种生命中非常独特的运动形式，是机体在生命活动中所进行的一种自我调节以及自我保护的过程，对于机体的正常生理和心理方面的维护都有非常关键的作用。睡眠剥夺表示因为环境或个体原因导致睡眠的质量下降或者睡眠数量减少的一种状态。睡眠剥夺不仅可以引起机体行为、情绪、学习、记忆等方面的变化，还能引起激素分泌、神经递质释放、即刻早期基因表达及一些特异蛋白表达的变化，从而影响人体的正常生理功能。

改良多平台睡眠剥夺法（MMPM）是平台睡眠剥夺技术（platform technique）［2］的改进，也是利用大鼠怕水及在水中无法睡眠的习性基本原理，把10只大鼠同时放在装有15个小平台的水槽中，大鼠想要睡眠进入REM期时由于全身肌张力的下降，引起节律性低头、触水、惊醒，以此来达到剥夺REM睡眠的目的。实验中既能模拟大鼠群居生活环境在，又可以允许大鼠在不同平台间自由活动，这样不但避免了单平台睡眠剥夺法（SP）及多平台睡眠剥夺法（MP）中单只大鼠与群体隔离的缺点而且同时保留了多平台睡眠剥夺法（MP）中活动范围增大的优点。

旷场试验通常用来测定大鼠的活动性、探索性和焦虑样行为，动物心理学研究中用来观察动物应激反应行为变化的一个比较直接的方法。旷场试验分值分为垂直活动得分和水平活动得分，主要反映动物对周围环境的不确定性、探究趋势及兴奋性［5-7］。本实验中，NC组和TC组在水平活动得分和垂直活动得分虽略有差异，但无统计学意义，说明大平台组大鼠随着时间延长对水环境产生适应性；SD 1天组两方面得分均高于对照组（P＜0.05），而SD 5天组得分明显高于两对照组（P＜0.01），说明睡眠剥夺前期大鼠兴奋性和探索性增加，而SD 9天组两方面得分却明显低于大平台对照组和正常对照组，且差异也具有明显的统计学意义（P＜0.01），大鼠行为能力迅速下降。说明在整个睡眠剥夺过程中，大鼠的兴奋性及探索性先增强，然后随着剥夺时间增长机体机能出现衰退，大鼠的兴奋性及探索能力也随之降低，呈现萎靡状态，结果和刘诗翔［8］研究相似。大鼠作为一种社会学动物，在睡眠剥夺进程中先表现出活动增多，兴奋性明显提高、继而出容易激惹易怒状态，最后呈现出身体极度疲弱、甚至濒死的状态。与人类经常失眠后会表现出精神易兴奋，脑力易疲劳，情绪不稳定继而无精打采、抑郁冷漠等行为有很大程度的相似性。

应激指的是机体对外界或内部各种刺激所产生的非特异性应答反应的总和，应激反应激发交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质激素分泌，引起的机体内部生理机能的变化和细胞代谢的改变。睡眠剥夺作为一种典型的内源性氧化应激在激发机体发生应激反应中，目前，作为评价动物应激程度的指标，研究中大多采用测定动物血清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropin，ACTH）、皮质醇（cortisol，CORT）及促甲状腺激素（thyrotropin，TSH）等激素水平的变化进行判断［9］。

本实验中，大鼠血清ACTH、CORT及TSH含量变化趋势基本一致（先升后降），可能是大鼠经受睡眠剥夺这一应激后，内源性氧化应激反应激活HPA轴，下丘脑首先产生兴奋，产生释放促肾上腺皮质激素释放激素，该激素经由垂体束中的门脉系统运输到垂体前叶。垂体前叶促皮质激素细胞受到促肾上腺皮质激素释放激素的作用，产生并释放促肾上腺皮质激素ACTH，ACTH通过血液到达肾上腺的皮质区域，促进肾上腺迅速合成CORT，引起CORT分泌增多。同时，应激状态也激活了下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴，SD初期，下丘脑首先兴奋产生促甲状腺激素释放激素（TRH），该激素被运输到垂体前叶后刺激垂体产生促甲状腺激素（TSH）生成，血清中TSH水平升高，但随着SD的延长，神经内分泌反馈环路出现恶性循环，机体生理性应激反应过度，最终造成机体神经内分泌器官的损伤，从而引起ACTH、CORT及TSH含量的迅速降低，导致机体应激反应紊乱。

总之，改良多平台睡眠剥夺法可建立有效的大鼠睡眠剥夺模型，准确可靠的模拟大鼠睡眠剥夺状态，行为学及血清学指标是评价睡眠剥夺动物模型建立成功与否的有效方法。该模型可为后续研究睡眠障碍对大鼠口颌系统运动功能的影响奠定基础。

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［2015-05-14收稿，2015-06-12修回］

［本文编辑：韩仲琪］

Establishment and evaluation of partial sleep deprivation model of rats by modified multiple p latform method

HE Yu-hong，WANG Pei-huan，WU Gao-yi，et al.Department of Stomatology，the General Hospital of Jinan Military Region of Chinese PLA，Jinan，Shandong 250031，China

Objective To establish the partial sleep deprivation model of rats by modified multiple platform method and to evaluate it.M ethods Fifty rats were randomly divided into five groups，1d，5d，9d sleep deprivation group，normal control group，and big platform control group；Modified multiple platform method was adopted to establish the rat sleep deprivation model；At each period the rats＇behavior change，the content changes of CORT，ACTH and TSH in serum after sleep deprivation were observed.Result s The basic situation of rats changed much in sleep deprivation groups.Big platform control group and normal control group had no statistical difference on rearing scores and crossing scores（P＞0.05）.Both SD1d group and SD5d group had significant difference in rearing scores and crossing scores compared with control group.SD9d group had lower rearing score and crossing score than that of normal control group and the big platform group，and had significant difference（P＜0.05）.Compared with normal control group and a big platform control，it presents the trend of first increase and then decrease about the content level of adrenocorticotropic hormone（CORT），cortisol（ACTH），thyroid stimulating hormone（TSH）in serum of rats with duration of sleep deprivation.Conclusion Through improv ing multiple platform sleep deprivation method to establish the rat model of sleep deprivation it has a good simulation in the effect of sleep deprivation.It can be used in the study about sleep disorder of rats.

Sleep deprivation；Open field test；Modified multiple platform method

R338.36：R-331

A

济南军区总医院院长基金资助项目（2012Q003）

250031山东济南，济南军区总医院口腔科（何玉宏，王培欢，吴高义，孙志卫，席兰兰）