腺苷注射液治疗肺挫伤的作用机制

吴卫春　张丽萍　杜　峰　梁　治　林　伟　王胜利

腺苷注射液治疗肺挫伤的作用机制

吴卫春张丽萍杜峰梁治林伟王胜利

目的 探讨腺苷注射液对撞击所致肺挫伤的治疗作用机制。方法 选取30只健康日本大耳兔，随机分为对照组和腺苷注射液治疗组，各15只。用 BIM-II型生物撞击机制备兔肺挫伤模型。分别于撞击前10min﹑撞击后1h﹑3h﹑5h﹑7h采集颈总动脉血检测丙二醛（MDA）﹑白介素-10（IL-10）的浓度；于伤后7h取下右肺，测定肺组织中髓过氧化物酶（MPO）含量；测定支气管肺泡灌洗液中的肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）含量和肺泡表面活性物质（PS）水平；解剖观察肺组织和病理改变。结果 对照组血浆MDA浓度﹑肺组织中MPO含量﹑支气管肺泡灌洗液中TNF-α浓度﹑NE活性较腺苷组显著升高，而腺苷组血浆IL-10浓度和支气管肺泡灌洗液中总磷脂TPL含量较对照组明显高，同时腺苷治疗组肺组织的病理损害明显较对照组减轻。结论 腺苷注射液对肺挫伤有治疗作用，其机制可能与调节肺挫伤早期炎性因子浓度有关。

胸部损伤 肺 腺苷注射液

肺挫伤是指暴力作用于胸壁，使胸腔容积缩小，增高的胸内压力压迫肺组织，引起肺出血、水肿；外力消除后胸廓回弹，在产生胸内负压的瞬间又导致原损伤区再次受损［1］。临床上对肺挫伤的治疗尚缺乏有效的药物。国内外在腺苷预处理对肺的保护作用［2］已有较深入的研究。2012年6月至2014年6月作者通过实验观察腺苷对肺挫伤的治疗作用，并探讨其可能机制，旨在为临床救治肺挫伤提供方法和实验依据。

1　材料与方法

1.1动物分组及模型建立 健康日本大耳兔30只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，由温州医科大学实验动物中心提供，随机分为对照租（单纯撞击组）和腺苷组（撞击后腺苷注射液干预组），各15只，撞击后立即予等渗盐水经兔耳缘静脉滴注维持循环稳定7h，腺苷组于撞击后30min开始予腺苷注射液3mg/（kg·h）经耳缘静脉滴注（沈阳光大制药）。参照吴正国等［3］的方法用BIM-2水平式生物撞击机制，制备兔肺挫伤模型。将兔架直立，撞击兔右侧胸部，撞击点位于兔右侧第3、4肋间与腋中线交界处，撞击参数：采用准静态撞击，驱动压力为650kPa，撞击面积为4cm2，胸壁压缩3cm，撞击时相为吸气末，撞击后呼吸循环稳定，未出现严重并发症。

1.2标本采集与测定 分别于撞击前10min、撞击后1h、3h、5h、7h采颈总动脉血检测丙二醛（MDA）、白介素-10（IL-10）。血清MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；血清IL-10采用ELISA测定；于伤后7h取下右肺，取其中的0.1g肺组织采用比色法测定肺组织中髓过氧化物酶（MPO）含量；按常规方法收集支气管肺泡灌洗液（BALF），ELISA试剂盒测定支气管肺泡灌洗液中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量；测定肺泡表面活性物质（PS）水平，收集BALF以2层无菌纱布过滤后以1500r/min离心10min，分离出上清液，分装后置-20℃保存待测定，测定总磷脂TPL和中性粒细胞弹性蛋白酶NE活性。试剂盒均购自上海西塘生物科技有限公司，操作按试剂盒说明进行。取右下肺1cm×1cm×1cm大小组织作光镜检查，随机取两组中各8只兔肺作电镜检查，观察肺组织形态学改变。

1.3统计学分析 采用SPSS 12.5统计软件。计量资料以（±s）表示，组内比较用单因素方差分析，组间比较用t检验，方差不齐用Dunnett’s T3检验，方差齐用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组兔血浆MDA浓度的变化比较 见表1。

表1　两组兔血浆MDA浓度变化比较［nmol/ml，（x±s］

2.2两组兔血浆IL-10浓度的变化比较 见表2。

表2　两组兔血浆IL-10浓度变化比较［pg/ml，（x±s）］

2.3两组兔肺组织中MPO、TNF-α、NE、TPL比较 见表3。

表3　两组兔肺组织MPO、TNF-α、NE、TPL比较（x±s）

2.4两组肺组织形态学变化 对照组肺组织实变明显，表面有散在红色斑片，光镜下肺泡结构破坏，部分萎缩，大量中性粒细胞为主的炎性细胞及红细胞、血小板等聚集（见图1A）；电镜下II型细胞部分破坏，相邻肺泡间质水肿增厚，线粒体肿胀空泡化，微绒毛和板层小体稀少（见图1B）。腺苷组光镜下肺泡结构基本正常，PMN少（见图1C）；电镜下肺泡II型细胞形态基本正常，肺泡壁薄，肺泡间隔轻度水肿，线粒体无明显肿胀，微绒毛较多，板层小体丰富（见图1D）。

图1　两组肺组织形态学改变（A﹑B光镜，C﹑D电镜）

3　讨论

胸部撞击后肺挫伤的机制目前尚未完全清楚。血浆MDA为自由基脂质过氧化的醛式产物，是脂质过氧化代谢的主要中间产物，其醛基能与血管内皮、神经元等细胞生物膜磷脂中的氨基组分发生交联聚合反应，使生物膜的结构和功能发生改变，引起膜通透性增加、膜上的Na+-K+-ATP 酶失活、线粒体功能障碍等，从而导致细胞内Ca2+超载，并激发自由基链式反应，并形成恶性循环。本资料用硫代巴比妥酸比色法测定MDA的含量，不仅反映氧自由基生成与否及其清除情况，还反映出氧自由基造成组织损伤的严重程度。血浆IL-10是一种抗炎症细胞因子，其具有较强的抗炎作用，可以抑制某些因子如IFN-γ、IL-1-β、IL-2、TNF-α等的合成及活性，降低各自的mRNA水平及粘附分子的表达［4］；同时又对抗炎症物质如IL-1Ra具有正向调节作用，提高其浓度和活性。MPO是中性粒细胞胞浆中的一种特异性酶，肺组织中MPO活性的变化可反映中性粒细胞在肺组织的聚集程度，标志中性粒细胞活化和聚集。“呼吸爆发” 是激活的中性粒细胞释放氧自由基的方式，释放的氧自由基引起肺组织脂质过氧化损伤，同时释放弹性蛋白酶、溶酶体酶等损伤和破坏肺组织结构导致肺水肿。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）由单核巨噬细胞、T细胞释放，是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，能参与体内多种疾病的发生和发展。TNF-α可以引起体内一系列的病理反应，如诱导中性粒细胞的“呼吸爆发”；刺激多种细胞因子的生成、释放，参与到肺水肿的形成；表达细胞粘附分子，激活白细胞粘附活性［5］。El-Awady等［6］通过对肺挫伤患者的支气管肺泡灌洗液分析，发现肺挫伤导致肺泡Ⅱ型上皮细胞生成和分泌的表面活性物质减少；同时以TNF-α为主的肺泡内的炎性因子使表面活性物质降解加速。PS的减少和呼吸道内分泌物的阻塞促使肺不张的发生。肺不张一方面影响肺的通气换气功能，另一方面又进一步加重肺部炎症反应，并形成恶性循环，加重肺损伤。

外源性腺苷未作为能量底物发挥作用，其主要作用于腺苷受体，其可能的机制为：（1）抑制中性粒细胞（PMNs）、内皮细胞及其相互作用：国外学者发现，腺苷可以抑制内皮细胞凋亡［7］，且可抑制PMNs的CD11/CD18表达和抑制血小板活化因子［8］。（2）减轻细胞内钙超载：腺苷激活A1受体，开放ATP敏感K通道（KATP），通过电压依赖性Ca2+通道，降低Ca2+内流，保护细胞内ATP［9］，该作用可被KATP通道阻滞剂所阻断［10］。（3）腺苷可以有效恢复高能磷酸储备。（4）腺苷还可以抑制血小板的聚集，防止血栓的形成：研究证实腺苷能降低ADP诱导的血小板聚集，抑制血栓烷素A2的释放，从而保护内皮细胞的结构和功能，且通过降低细胞内Ca2+浓度，抑制Ca2+诱发的血小板聚集。（5）腺苷的抗氧化作用：Rupprecht H等［11］通过实验发现腺苷对氧自由基有显著的抑制作用，腺苷可通过腺苷A2受体使中性粒细胞产生的超氧阴离子减少。

1 王正国.我国道路交通伤的现状，中华创伤杂志，2000，16（4）：200～201.

2 刘勇，贺春熙.腺苷预处理对小儿体外循外肺损伤的保护作用，医学研究杂志，2012，41（5）：77～79.

3 吴正国，梁贵友，李正勋，等. 参芪扶正注射液对心肌挫伤后家兔心肌细胞凋亡的影响. 第三军医大学学报，2007，29（7）：588～591.

4 Avdic S， Cao JZ， McSharry BP， et al. Human cytomegalovirus interleukin-10 polarizes monocytes toward a deactivated M2c phenotype to repress host immune responses.J Virol，2013， 87（18）：10273～10282.

5 Vinokurov M， Ostrov V， Yurinskaya M， et al. Recombinant human Hsp70 protects against lipoteichoic acid-induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels. Cell Stress Chaperones， 2012， 17（1）：89～101.

6 El-Awady MS， Rajamani U， Teng B， et al. Evidence for the involvement of NADPH oxidase in adenosine receptors-mediated control of coronary flow using A1 and A3 knockout mice. Physiol Rep， 2013， 1（3）：163～170.

7 Zhao ZQ， Nakamura M， Wang NP， et al. Administration of adenosine during reperfusionreduces injury of vascular endothelium and death of myocytes. Coron Artery Dis，1999， 10（8）：617～628.

8 Kaji W， Tanaka S， Tsukimoto M， et al. Adenosine A（2B） receptor antagonist PSB603 suppresses tumor growth and metastasis by inhibiting induction of regulatory T cells. J Toxicol Sci， 2014， 39（2）：191～198.

9 Lochner A， Marais E， Huisamen B， et al. Protection of the ischaemic heart： investigations into the phenomenon of ischaemic preconditioning. Cardiovasc J Afr， 2009， 20（1）：43～51.

10 G Kounis N， Soufras GD ， Tsigkas G ，et al.Adverse cardiac events to monoclonal antibodies used for cancer therapy： The risk of Kounis syndrome. Oncoimmunology， 2014， 14（3）： e27987.

11 Rupprecht H， Ghidau M. Penetrating nail-gun injury of the heart managed by adenosine-induced asystole in the absence of a heart-lung machine. Tex Heart Inst J， 2014， 41（4）：429～432.

Objective To investigate the mechanism of adenosine injection in the treatment of lung contusion following chest impact. Methods Thirty healthy Japan big-ear rabbits were randomly assigned to the lung contusion control group（control group，n=15）and adenosine injection group（adenosine group，n=15）.The rabbits with lung contusion were induced by BIM-II Horizontal Bioimpact Machine. Blood samples were taken from common carotid artery of both groups to measure the levels of plasma malondialdehyde（ MDA） and IL-10 at 10 minutes before impact and1，3，5，7 hours after impact.Rabbits were dissected to observe the gross and micmpathological changes of the lung at 7 hours after impact，the lung tissue myeloperoxidase（MPO） acticity and tumor necrosis factor-A（TNF-α） and elastase（NE） contents in bronchalveor lavage fluid（BALF） were obtained. Results The control group showed a distinct increasing of plasma MDA and the lung tissue MPO acticity and TNF-α and NE contents in BALF，The morphological observation revealed severe lung tissue injury as well. The adenosine group showed a distinict inreasing of plasma IL-10 and TPL contents in BALF. Conclusion Adenosine injection has therapeutic effect on lung contusion by regulating infl ammatory factor levels in the early period after lung contusion.

Thoracic injuries Lung Adenosine injection

杭州市卫生科技计划资助项目（2012B029）

311100 浙江大学医学院附属第二医院余杭分院心胸外科 （吴卫春 张丽萍 杜峰 梁治 林伟 ）325035 温州医科大学附属第二医院 （王胜利）