大肠癌组织中Six1和CyclinD1的表达及其临床意义

朱鹏武　吴春松　郑海红

大肠癌组织中Six1和CyclinD1的表达及其临床意义

朱鹏武吴春松郑海红

目的 探讨胚胎发育调节因子（Six1）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）在大肠癌组织中的表达及其临床意义，分析Six1和CyclinD1表达的相关性。方法 采用免疫组化En Vision法检测65例大肠癌组织和20例癌旁正常组织中Six1和CyclinD1的表达。结果 大肠癌组织中Six1和CyclinD1的阳性表达率分别为 70.77% 和60.00%，均明显高于癌旁正常组织的15.00% 和0%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Six1和CyclinD1表达与大肠癌患者临床分期﹑浸润深度及淋巴结是否转移有关（P＜0.05），而与患者年龄﹑性别﹑肿瘤大小及分化程度无关（P＞0.05）。大肠癌组织中Six1和CyclinD1的表达呈正相关（P＜0.05）。结论 Six1和CyclinD1过表达可能与大肠癌的发生﹑发展密切相关，联合检测Six1和CyclinD1表达可用于评估大肠癌的浸润﹑转移能力和预后。

大肠癌 Six1 CyclinD1 浸润 转移

大肠癌是全球肿瘤相关死亡的第2位常见的原因，约50%大肠癌患者死于远处转移相关的并发症［1］。Six1蛋白参与染色质重构和基因的转录，在细胞凋亡过程中起着重要的作用。Six1过表达与肝癌［2］、胃癌［3］和宫颈癌［4］等多种肿瘤的不良预后有关。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一个重要的细胞周期调节蛋白，在细胞周期G1/S关键点起着正向调控作用。研究［5］认为，脑胶质瘤中CyclinD1表达升高，提示CyclinD1可能在胶质瘤的发生过程中发挥重要作用。本文旨在探讨Six1和CyclinD1联合表达的临床意义。

1　临床资料

1.1一般资料 选取2009年10月至2013年12月临海市第一人民医院和台州医院手术切除大肠癌标本65例，标本均经病理检查明确诊断，患者术前均未接受放疗、化疗、生物治疗或免疫治疗。其中男35例，女30例；年龄32～80岁，平均（60.35±12.87）岁。组织学分级：高中分化37例、低分化28例。参照2010年美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）修订的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期34例。淋巴结转移情况：有转移20例、无转移45例。所有患者均有完整的临床病理资料。选择同期20例癌旁组织为对照组，癌旁组织距肿瘤原发灶＞5cm，病理证实为正常大肠组织。

1.2主要试剂 兔抗人Six1单克隆抗体购自美国Sigma公司，兔抗人CyclinD1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，即用型羊抗兔免疫组化En VisionTM检测试剂盒和DAB显色剂均购自Dako公司。

1.3检测方法 所有组织标本离体后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋保存。采用En Vision二步法进行免疫组化染色，高压锅进行抗原修复，正常山羊血清封闭30min，一抗4℃冰箱过夜，二抗孵育30min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知阳性片作阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照。

1.4结果判定 Six1和CyclinD1染色阳性信号为出现棕黄色颗粒，均定位于细胞核。选取＞5个高倍视野（×400），每个视野计数≥200个细胞中的阳性细胞数，阳性细胞数≥10%为阳性，＜10%为阴性。

1.5统计学方法 采用SPSS13.0软件。Six1和CyclinD1在大肠癌中的表达及与临床病理特征的关系采用χ2检验，两者表达的相关性采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大肠癌和癌旁正常组织中Six1和CyclinD1的表达 Six1和CyclinD1均以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性（见图1和图2）。大肠癌组织中Six1和CyclinD1的阳性表达率分别为70.77% 和60.00 %，均明显高于癌旁正常组织的15.00 % 和0 %，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1　Six1在大肠癌组织中阳性表达（En Vision×400）

图2　CyclinD1在大肠癌组织中阳性表达（En Vision×400）

表1　Six1和CyclinD1在大肠癌和癌旁正常组织中的表达［n（%）］

2.2Six1和CyclinD1表达与大肠癌临床病理特征的关系 Six1和CyclinD1蛋白表达在大肠癌患者临床分期、浸润深度及淋巴结是否转移差异有统计学意义（P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无关（P＞0.05）。见表2。

表2　Six1和CyclinD1表达与大肠癌临床病理特征的关系［n（%）］

2.3大肠癌组织中Six1和CyclinD1表达的相关性 65例大肠癌组织中，Six1和CyclinD1表达共阳性36例，阴性16例，Six1和CyclinD1蛋白表达呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表3　Six1和CyclinD1在大肠癌组织中表达的相关性（n）

3　讨论

Six1是转录因子Six同源结构域家族成员之一，是一种进化上高度保守的转录因子［6］。早期的研究显示，Six1是胚胎发育的关键调节因子，可通过与Eya家族蛋白相互作用激活基因转录，参与神经、肌肉和肾的发生［7］。近来研究［8，9］认为，Six1在多种肿瘤细胞中呈现高表达，在恶性肿瘤增殖、转移和存活中起着重要作用。Li等［10］采用慢病毒载体介导的短发夹RNA（shRNA）基因敲除的方法来抑制大肠癌细胞Six1表达。研究表明shRNA能有效地降低其表达在大肠癌细胞中Six1 mRNA和蛋白水平。体外功能实验表明，下调Six1显著抑制细胞增殖，抑制结、直肠癌细胞迁移和侵袭。此外，肿瘤异种移植模型表明，下调Six1显著抑制体内的大肠癌生长。CyclinD1属于Cyclins家族成员之一。CyclinD1定位于11q13，包含5个外显子和4个内含子，编码295个氨基酸，分子量为34KD。CyclinD1是细胞周期起始和进展的一个重要传感器和激活器，CyclinD1过表达可诱导细胞周期从G1期进入S期引起细胞周期调控异常，导致细胞无限增殖。在一些恶性肿瘤中CyclinD1表达升高被认为与肿瘤的进展和系统治疗反应有关［11］。

本资料结果显示，大肠癌组织中Six1和CyclinD1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义。提示Six1和CyclinD1过表达可能参与大肠黏膜上综上所述，大肠癌组织中Six1和CyclinD1呈现过表达，其表达可能与大肠癌的发生、发展密切相关，联合检测Six1和CyclinD1表达情况可用于评估大肠癌的局部浸润、远处转移能力和预后。

皮恶性转化。进一步研究结果分析，Six1和CyclinD1蛋白表达在大肠癌患者临床分期、浸润深度及淋巴结是否转移间的差异有统计学意义（P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无关（P＞0.05）。表明联合检测Six1和CyclinD1蛋白表达情况可用于评估大肠癌的局部浸润、远处转移能力和预后。Spearman等级相关分析结果显示，大肠癌组织中Six1和CyclinD1表达呈正相关。提示Six1表达升高，可能通过调控CyclinD1表达上调，进而调节细胞周期异常，导致细胞增殖异常。与Li等［12］研究认为Six1通过上调CyclinD1促进细胞周期进展和细胞增殖的结果一致。

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6 Wu W， Ren Z， LiuH，Wang L， HuangR， Chen J， et al. Core promoter analysis of porcine Six1 gene and its regulation of the promoter activity by CpG methylation. Gene. 2013；529（2）：238～244.

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11 Peurala E， Koivunen P， Haapasaari KM， et al. The prognositic significance and value of cyclinD1， CDK4 and p16 in human breast cancer. Breast Cancer Res， 2013，15（1）：R5.

12 Li Z， Tian T， Lv F， et al. Six1 Promotes Proliferation of Pancreatic Cancer Cells via Upregulation of Cyclin D1 Expression. PLoS One，2013，8（3）：e59203.

Objiective To study the expression of Six1 and CyclinD1 in colorectal cancer and its clinical signifi cance，analyzing the relationship between expression of Six1 and CyclinD1 protein. Methods The expressions of Six1 and CyclinD1 in 65 cases of colorectal cancer and 20 cases of corresponding para-carcinoma colorectal mucosa tissues were deteted by immunohitochemical En Vision method. Results The positive rate of Six1 and CyclinD1 protein in colorectal cancer tissues was 70.77% and 60.00% respectively，compared to para-carcinoma colorectal tissues（15.00% and 0%），the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The expression of Six1 and CyclinD1 protein was correlated with clinical stage，infi ltration depth and lymoh node metastasis（P＜0.05），but no correlated with age，sex，tumor size or degree of differentiation（P＞0.05）. Exressions of Six1 were negatively associated with expression of CyclinD1 in colorectal cancer（P＜0.05）. Conclusions The overexpression of Six1 and CyclinD1 is closely associated with occurrence and development of colorectal cancer The combined detection of Six1 and CyclinD1 expression may be used to assess the ability of invasion，metastasis and prognosis of colorectal cancer.

Colorectal cancer Six1 CyclinD1 Invasion Metastasis

317000浙江省临海市第一人民医院消化内科（朱鹏武吴春松）317000 浙江省台州医院病理科（郑海红）