质谱图筛选红曲红色素纯化方法

刘立增，孟宪昉，白正晨，王莉

（天津商业大学理学院，天津300134）

质谱图筛选红曲红色素纯化方法

刘立增，孟宪昉，白正晨，王莉

（天津商业大学理学院，天津300134）

以商品化的红曲米为原料，利用质谱图定性分析，考察在红曲红色素提取过程中冷冻，索氏提取，溶剂，柱色谱，薄层色谱等因素对分离效果的影响，筛选并分离得到一种分子离子峰为332.6红曲红色素分子。研究结果表明该红曲红色素分子的纯化条件依次为：以甲醇为淋洗剂对红曲米进行柱色谱分离，以正己烷、乙酸乙酯和甲醇为萃取剂进行一次索氏提取，以CH2Cl2∶CH3OH=1∶1为展开剂进行薄层色谱分离，收集Rf=0.8的色带，以CH3CH2OH∶CCl4= 9∶1为展开剂进行第二次薄层色谱分离，收集Rf=0.8的色带为目标分子，收率为0.012 6%。

红曲红色素；分离；质谱；薄层色谱法

红曲色素符合食品着色剂-天然、营养、多功能的发展方向，是我国传统的食用红色色素之一，为我国特有的产品，在食品、医药等领域具有很好的应用前景［1-3］。红曲米是采用把红曲霉属（Monascus）菌种接种在大米上繁殖而成的。作为一种天然色素制品，红曲色素是从红色或紫红色米曲中提取得到的。使用不同的红曲菌株、培养基、发酵条件所产生的红曲色素组成有较大差异，同时在发酵过程中，由红曲色素与发酵基质中的氨基酸、肽、蛋白质等发生反应形成红曲衍生色素，使其组成和呈色效果更加复杂。从红曲米中提取的红曲色素实际上是混合物，一般含有多种杂质。其中有些成分会影响天然色素的稳定性和着色度，有些成分甚至存在使用安全性的问题。目前WHO、FAO及其欧美等19个国家使用的48种天然色素中没有包括红曲色素。为明确红曲色素混合物的组成成分、明确各组分的溶解性、稳定性等，以及为筛选高产色素菌株、优化发酵条件、优化色素的提取工艺、改变提取技术等研究，需要对食品生产所用的红曲色素进行分离。故此，寻找较好的提取纯化方法是为了进一步开发红曲色素、推广使用红曲食用色素的关键之一。

目前红曲色素的分离主要采用薄层色谱（Thin-Layer Chromatography，TLC）［4］、柱层析法［5］、树脂吸附分离法、高速逆流色谱法（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）、HPLC法等方法［6］。然后需要采用薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等方法辅助，对所分离得到的红曲色素进行检测。其中薄层色谱法，分光光度法，高效液相色谱法虽然可以建立红曲色素中各单色调特征组分的定性定量检测方法，但是由于没有红曲中各单一色素的标准品的出售，使其用于定性定量检测红曲色素各单一组分受到限制［7-10］。TLC法可以较好的分离、分析红曲色素的级分，结合质谱技术可鉴定红曲色素的组成及纯度。综上所述，本研究采用薄层色谱方法为分离提纯方法，以电喷雾质谱（ESI）为定性分析辅助手段，对山东中惠食品有限公司生产的红曲红中所含的红曲色素进行了快速、有效分离。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

红曲红：山东中惠食品有限公司；薄层层析硅胶板GF254（20 cm×20 cm）、柱层析硅胶（200目～300目）：青岛海洋化工有限公司；无水甲醇、无水乙醇、石油醚（30℃～60℃）、二氯甲烷、四氯化碳、正己烷、乙酸乙酯（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；旋转蒸发器RE-52AA型：上海亚荣生化仪器厂；LCQ DECA XP MAX离子肼质谱仪：美国Thermofisher公司。

1.2方法

1.2.1分离红曲色素中的红曲红色素的方法

按照图1所示工艺流程进行了如下实验：

图1　分离红曲色素中的红色素2种工艺流程Fig.1Two processes of separation and purification of the commercial monascus red pigments

实验I和II：将市售红曲红20 g溶于600 mL 45℃水中。然后置于冰箱中进行24 h冷冻。常温下解冻后，200 r/min下对解冻液进行离心，上清液旋转蒸发除去溶剂。100℃烘干。对所得色素进行1次（I）或2次（II）索氏提取，萃取溶剂依次为正己烷、乙酸乙酯和甲醇（各150 mL）。将所得甲醇提取液浓缩后，采用薄层色谱进行分离［CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（体积比）］。

实验III和IV：将市售红曲红20 g溶于300 mL甲醇中，过200目～300目硅胶快速柱（直径45 mm，淋洗剂为甲醇）。旋转蒸发除去溶剂。对所得色素进行1次索氏提取，萃取溶剂依次为正己烷、乙酸乙酯和甲醇（各150 mL）。将所得甲醇提取液浓缩后，采用薄层色谱进行分离［CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（体积比）］。收集第一主色带，采用三种不同展开剂进行第二次薄层色谱分离［展开剂1∶CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（体积比）；展开剂2∶CH3CH2OH∶石油醚=3∶7（体积比）；展开剂3∶CH3CH2OH∶CCl4=9∶1（体积比）］。

1.2.2质谱图测试条件

本文质谱扫描采用电喷雾（ESI）离子源，样品由注射泵直接进样。正离子扫描模式；鞘气和辅助器均为高纯氮气（纯度大于99.999%），鞘气流量15个任意值单位（arb unit），电喷雾电压4.5 kV，毛细管温度200℃。

2结果与讨论

2.1质谱方法的选择

质谱法是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。组成质谱仪的四部分（进样系统、离子源、质量分析器、检测器）中，我们常根据离子源的不同将质谱分为EI源质谱，ESI源质谱、FAB源质谱等等。其中电子轰击电离（EI）对于固体样品，通过进样杆将待测样品直接导入进行测试，操作简便。其缺点在于70eV的电子轰击，使样品碎片离子峰较多，而且对于难挥发和热稳定性差的样品不适用。电喷雾电离源（ESI）是一种软电离方式，比EI容易得到比较强的分子离子或准分子离子，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解。目前已知结构的红曲色素是一系列聚酮化合物：红色色素（Rubropunctamine红斑胺素、Monascorubramine红曲红胺素）、橙色色素（Rubropunctatine红斑素、Monascorubrine红曲红素）和黄色色素（Monascine红曲素、Ankaflavine红曲黄素），其分子量，分子式，结构见图2［11］。

图2　六种主要红曲色素分子结构和分子量Fig.2The molecular structure and molecular weight of six major monascus

由图2可以看出红曲色素是由一个五元内酯、六元环酮和六元环醚或环胺组成其主体结构，此种结构不易分解，具有一定的热稳定性。对提取得到的同一样品EI和ESI比对，本实验采用ESI源进行质谱测试为更好的定性表征手段。

2.2索氏提取、冷冻、快速柱色谱的作用

本文所研究的原色素提取，方法Ⅰ-Ⅳ流程中（图1），采用了文献报道中常见的冷冻、索氏提取和柱色谱等提纯手段［12-13］。

分别用正己烷索氏提取出黄色色素、乙酸乙酯提取橙色色素，最后甲醇提取得到较纯的红曲红色素。

低温冷冻降低了蛋白或水溶性多肽在水中溶解度，从而可除去色素载体中所含有的蛋白杂质。

快速柱层析能直接过滤掉红曲色素中不溶性杂质和发酵过程中存在的极性偏高的物质，如氨基酸，各种盐类，以及淀粉等大分子化合物。

采用上述方法，可以在进行薄层色谱分离前，快速、有效的除去原色素中的非色素成分，有利于提高薄层色谱的分离效率。

2.3质谱辅助不同提取方法筛选红曲红色素

2.3.1ESI-MS辅助方法I和II筛选红曲红色素

按方法I和II所得初级品进行1次TLC展开。刮取Rf=0.75的色带（Bond 1），50 mL甲醇溶解，过滤。旋干。ESI质谱测试结果见图3。

图3方法I和II提取红曲红色素TLC板和质谱图Fig.3Picture of TLC plate for method I and II and the corresponding mass spectroscopy

图3（a）和（b）比较了提取过程中进行一次和两次索氏的质谱。在（a）和（b）中分子离子峰为332.3和332.6，丰度为100%；核质比为304.3和304.4的碎片离子峰，丰度分别为71%和46%。该碎片离子峰与分子离子峰相差28，应为核质比332.3的分子离子峰断裂了两个亚甲基-CH2的结果。对比图3（a）和（b）可知，在方法II中，进行两次索氏提取，正己烷、乙酸乙酯两种萃取用溶剂在提取出黄色色素、橙色色素的同时，明显降低了核质比大于500以上的杂质分子的含量，提取纯度优于一次索氏提取。

2.3.2ESI-MS辅助方法III和IV筛选红曲红色素

按方法III和IV所得初级品进行1次或2次TLC展开。ESI质谱测试结果见图4。

图4（a）和（d）可知，分子离子峰都为332.3和332.6，丰度均为100%；各有一个核质比为304.4和304.5的碎片离子峰，丰度分别为47%和28%。该碎片离子峰与分子离子峰相差28，应为分子离子峰断裂了两个亚甲基-CH2的结果。对比图4（a）和（d）可知，1次TLC展开，Bond 1中含分子离子峰为578.8，670.8和690.8的杂质峰，丰度分别为33%，42%和27%。以CH3CH2OH∶CCl4=9∶1作为二次TLC展开剂，收集Rf= 0.8的色带质谱图显示分子离子峰为332.6，丰度均为100%，碎片峰核质比为304.5，丰度为47%，杂质峰丰度低，所提取得到的红曲红色素纯度高。同时比较了CH2Cl2∶CH3OH=1∶1；CH3CH2OH∶石油醚=3∶7；CH3CH2OH∶CCl4=9∶1三种不同展开剂TLC分离效果。图4（b）为CH2Cl2∶CH3OH=1∶1作二次TLC展开剂，质谱图显示分子离子峰都为332.6，丰度均为100%，在400～600之间有微量杂峰存在。图4（c）为CH3CH2OH∶石油醚=3∶7作二次TLC展开剂，由于石油醚自身是一混合物，使得该复合展开剂分离效果较差，同时核质比为169.1，220.1的杂峰丰度较高，分别为70%和47%。经比较三种TLC展开剂分离得到的红曲红色素ESI质谱，可知CH3CH2OH∶CCl4=9∶1的分离效果优于另外两种展开剂。

2.3.3方法I和III筛选红曲红色素效果比较

图3（a）、（b）和图4（a）均为初级品进行1次TLC展开分离提纯后所得质谱。对比可知，商品化的红曲米原料进行柱色谱分离能快速有效的除去所含有的分子量在100～800范围内的大部分非色素分子。相对而言，采用冷冻，离心，烘干制备初级品的工艺路线去除杂质效果较差，又增加了分离操作步骤，增加了色素光分解可能性，降低了色素的分离收率。

2.3.4收率

称取红曲红粉末总量为20 g，按法IV，经过索氏提取，TLC等多次分离纯化最终得到了2.5 mg红曲红色素，产品的收率为0.0126%。

3结论

图4　方法III和IV提取红曲红色素TLC板和质谱图Fig.4Picture of TLC plate for method III和IV and the corresponding mass spectroscopy

虽然EI是最便捷快速的一种质谱方法，但电子轰击源能量较高，裂解碎片较多。用裂解碎片方式来了解化合物性质也不是本研究的目的。软电离ESI质谱更适合本研究所进行的红曲红色素的筛选工作。通过ESI质谱辅助，筛选出分子离子峰为332.6的一种未见报道的红曲红色素，确定该色素的分离、纯化实验条件为：甲醇为淋洗剂对红曲米进行柱色谱分离，以正己烷、乙酸乙酯和甲醇为萃取剂进行一次索氏提取，然后以CH2Cl2∶CH3OH=1∶1为展开剂进行薄层色谱分离，收集Rf=0.8的色带，最后以CH3CH2OH∶CCl4=9∶1为展开剂进行第二次薄层色谱分离，Rf=0.8的色带为目标分子，收率0.012 6%。本文的研究为今后食品加工中对分离、检测不同品种，不同批次的红曲米中的红曲色素提供了参考。

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MS Methods Assist Separation and Purification of A New Kind of Monasucs

LIU Li-zeng，MENG Xian-fang，BAI Zheng-chen，WANG Li
（School of Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Commercial monascus red pigments were used as the raw material，the influence of the freezing temperature，Soxhlet extraction，solvents，column chromatography and thin layer chromatography separation process assisted by the use of mass methods were studied in details.A new kind of monasucs was screened out from the raw materials，the molecular ion peak located at 332.5.The experimental conditions for the purification of the monascus was：Before the Soxhlet extraction which hexane，ethyl acetate and methanol as the separated solvents，the red yeast rice subjected to column chromatography by the methanol used as the eluent.Then CH2Cl2∶CH3OH=1∶1 were used as the eluent for the thin layer chromatography（Rf=0.8）.Finally，a second thin layer chromatography were carried out to collect the the target molecule bond（Rf=0.8）in which the CH3CH2OH∶CCl4=9∶1 were used as the corresponding eluents，yield 0.0126%.

monascus；separation；mass spectrometry；thin-layer chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.015

2014-09-03

刘立增（1973—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品科学。