苹果酵素对代谢性疾病模型小鼠的实验研究

马巧灵，申元英，，*，杨芳，郭乐，王云红，李超男

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理671000；2.大理大学基础医学院，云南大理671000）

苹果酵素对代谢性疾病模型小鼠的实验研究

马巧灵1，申元英1，2，*，杨芳1，郭乐1，王云红1，李超男2

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理671000；2.大理大学基础医学院，云南大理671000）

研究自制苹果酵素对高脂饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立II型糖尿病小鼠模型的降糖、降脂效果。造模成功的70只8周龄雄性昆明种小鼠随机分为正常组、模型组、酵素高剂量组、酵素中剂量组、酵素低剂量组及阳性组（二甲双胍），并分别对各组每天灌胃干预治疗28 d；检测每组小鼠空腹血糖（afsting blood glucose，FBG）、血脂（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）；每周称量每组小鼠体重，动态观察小鼠体重变化及小鼠饮食水量变化。模型组血糖较正常组上升（P＜0.05），且维持较好，说明造模成功；酵素高剂量组、阳性组空腹血糖及甘油三脂，总胆固醇较模型组有下降，且维持较好（P＜0.05）。酵素对II型糖尿病小鼠具有良好的降血糖、降血脂作用。

酵素；II型糖尿病；血糖；血脂；动物模型

II型糖尿病是由于胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足而引起碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱的综合征，约占糖尿病人总数的90%。糖尿病是全球性严重的公共卫生问题，发展迅速，对人类健康危害巨大。近年来，糖尿病及其并发症造成的医疗开支巨幅增长，并给发展中国家带来劳动力的巨大损失。

酵素广泛存在于自然界的生命体中，所有的生命活动与酵素密不可分，因此有“酵素是生命的起源”的说法［1］，微生物酵素中所含的微生物主要是酵母菌（接合酵母属Zygosaccharomyces spp．）、毕赤酵母Pichia spp．）、曲霉（米曲霉Aspergillus oryzae）、乳酸菌（明串珠菌leuconostoc spp．）［2］等。于晓艳［3］等研究认为蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等是微生物酵素类保健食品的主要功效酶。

通过自制苹果酵素对II型糖尿病模型小鼠血糖、血糖及血脂的影响研究，寻找一种较为安全的调节或治疗人类代谢疾病的方法。

1材料与方法

1.1试验试剂与仪器

血糖试纸条及血糖仪：购自艾康生物技术有限公司；葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇测定试剂盒：均购自长春汇力生物技术有限公司；UV-T6紫外分光光度仪：北京瑞利分析仪器公司；TGL-16G菲恰尔台式离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；灌胃针头、体重秤、脱脂棉。

1.2试验动物

清洁级昆明种雄性小鼠70只，购自大理学院实验动物中心，8周龄，体重（42±2.93）g，室温保持在20℃～25℃。动物自由进食、进水。开始试验前动物适应环境1周。随机将小鼠随机分为正常组（n=10），酵素高剂量组（n=12）、酵素中剂量组组（n=12）、酵素低剂量组（n= 12）、模型组（n=12）和二甲双胍组（n=12）。

1.3饲料

常规及高脂饲料，高脂饲料为（小鼠标准饲料+ 20%猪油+10%白砂糖+25%的蛋白质）。

1.4试验用药物

链脲佐菌素（STZ）美国Sigma公司，临时溶于0.1 mol/L，pH4.4的柠檬酸溶液中，0.22 μm微孔过滤，保持冰浴；4℃预冷，现用现配；盐酸二甲双胍片，10%甲醛溶液。

1.5试验方法

1.5.1动物造模

STZ致糖尿病小鼠模型的建立，雄性小鼠，普通饲料饲养1周，正常对照组喂基础饲料，余下各组小鼠喂高脂饮食，喂养4周后注射STZ，注射前禁食18 h，II型糖尿病模型组连续5 d小剂量70 mg/kg腹腔注射STZ，正常对照组注射等体积的柠檬酸缓冲液。注射后，正常对照组喂普通饲料；其余各组继续给予高脂饮食。小鼠禁食8 h后第7天后尾静脉取血测空腹血糖，用灭菌小剪刀剪尾取血，应用血糖仪测定血糖，血糖≥11.1 mmol/L确定为糖尿病模型成功。

1.5.2动物分组

将造模成功（II型糖尿病治疗组）的小鼠随机分成6组：正常对照组、酵素组（高、中、低）、阳性对照组（二甲双胍150 mg/kg）和模型组，所有糖尿病造模小鼠每天进行灌胃给药，连续给药28 d。

1.5.3统计分析

1.5.4生化指标检测

在第28天给药后禁食8 h，测定生化指标：空腹血糖、TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）作为评判酵素治疗II型糖尿病药效的指标。酵素对II型糖尿病小鼠体质量及空腹血糖的影响。体重作为衡量糖尿病小鼠症状的重要指标，试验过程中采用（42±2.93）g昆明种小鼠，经过28 d灌胃后，各组小鼠空腹血糖值，详见表1。如表1所示。

表1　酵素对小鼠血糖的影响Table 1Effects of enzyme on blood glucose in mice

由表1可知，模型对照组小鼠空腹血糖水平显著高于正常对照组（P＜0.05），血糖达22.31 mmol/L，表明小鼠高血糖模型成功。与模型对照组相比，阳性对照组的降血糖作用具有显著性差异（P＜0.05），同样模型组与酵素组比较血糖，具有统计学意义（P＜0.05），说明酵素能抑制糖尿病小鼠血糖升高。各组降糖率（降糖率=（治疗前血糖浓度一治疗后血糖浓度）/治疗前血糖浓度）：阳性组、酵素高剂量、中剂量组、低剂量组组分别为33.02%、20.44%、14.17%、11.28%，详见表2。

表2　酵素对小鼠体质量的影响（±s，g）Table 2Effects of enzyme on the weight in mice（±s，g）

表2　酵素对小鼠体质量的影响（±s，g）Table 2Effects of enzyme on the weight in mice（±s，g）

组别给药前给药后第7天第14天第21天第28天正常对照组43.52± 3.26 43.26± 1.96模型对照组42.71± 2.93 43.98± 1.39 43.62± 2.09 43.28± 1.56 35.02± 2.87酵素高剂量组42.50± 4.54 34.09± 4.17阳性对照组43.10± 1.96 36.64± 2.73 34.9± 2.89 34.10± 2.83 36.67± 3.05 34.61± 3.33 34.56± 3.36 34.83± 4.72酵素中剂量组42.58± 3.23 38.98± 5.49 35.45± 5.29 34.90± 4.27 35.31± 4.81酵素低剂量组43.66± 1.34 38.38± 5.05 35.05± 4.28 35.56± 3.96 41.31± 7.83 37.27± 7.99 37.62± 7.90 37.56± 7.87

从表2可见，正常对照组小鼠体重稳定，其他各组小鼠体重较给药前有下降趋势，造模初期体重下降幅度较大，后期处于一种相对稳定的状态。

1.5.5酵素对II型糖尿病小鼠血清中TC、TG的影响

据有关报道，糖尿病患者可发生异常高血脂症。本研究中STZ诱导糖尿病小鼠出现脂质代谢异常，主要特征为TG、TC值升高，而脂质代谢紊乱是糖尿病并发症之一，因此改善脂代谢异常也是糖尿病的有效治疗手段之一。经过28 d灌胃后，小鼠血脂指标，详见表3。

表3　酵素对小鼠血脂指标的影响（±s）Table 3Effects of enzyme on blood lipid in mice（±s）

表3　酵素对小鼠血脂指标的影响（±s）Table 3Effects of enzyme on blood lipid in mice（±s）

注:与正常组比较☆P＜0.05；模型组比较★P＜0.05。

组别例数（N）TG/（mmol/L）TC/（mmol/L）正常对照组90.88±0.34★2.01±0.76★模型对照组92.11±0.71☆5.93±0.67☆阳性对照组80.67±0.50☆★5.02±1.67☆酵素高剂量组100.38±0.26☆★3.76±1.38☆★酵素中剂量组90.43±0.35★4.13±1.64☆★酵素低剂量组90.86±0.39★4.88±0.98☆

如表3所示。模型对照组小鼠血清中TC、TG水平均显著高于空白组（P＜0.05）。酵素给药组能降低II型糖尿病小鼠血清TG、TC水平，尤其是酵素高剂量组降低血脂和总胆固醇明显，血清TG、TC水平总体上具有降低的趋势；而相对模型对照组与酵素组比较具有显著性差异（P＜0.05）；酵素具有调节II型糖尿病小鼠血脂和总胆固醇的作用，能显著降低小鼠血清中TG、TC水平。

2结论与讨论

II型糖尿病的病因非常复杂，涉及到遗传因素和环境因素的相互作用，其主要发病机制为胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对不足。发生II型糖尿病时多表现为高胰岛素血症、高血糖和肥胖，本研究中显示高脂饲料加一定剂量STZ小鼠的血糖、体重、饮水量均明显升高，本试验方案是经过预试的，在研究中使用的是高脂饲料，该饲料具有很高的诱导胰岛素抵抗和肥胖的成功率。

STZ为对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出II型糖尿病小鼠模型。小鼠对STZ有一定的耐受性，研究显示有一次性大剂量给药方法，也有连续多次给药方法，使用的药物剂量也从20 mg/kg至 240 mg/kg不等［4-5］，得到的模型的血糖水平以及血糖维持时间也有差距。注射150 mg/kg或者更大剂量可以引起明显的胰岛β细胞受损，使血糖明显升高，这种方法诱导迅速建立的是I型糖尿病模型。在本研究中使用70 mg/kg的STZ可以使胰岛β细胞发生轻度的受损，使血糖较注射前轻度升高。但是在高脂饲料的导致胰岛素抵抗的基础上，受损的胰岛β细胞不足以维持正常的血糖稳态，至少可以维持12 w，致使血糖显著升高［6］。

本试验以高脂饲料喂养4周与腹腔注射STZ，联合造II型糖尿病小鼠模型，考察了酵素对II型糖尿病小鼠的影响，并且自制的苹果酵素采用市售的可以放心食用的苹果，经过一段时间的发酵即可食用。28 d小鼠灌胃试验表明，酵素能缓解II型糖尿病小鼠多饮多食等症状的作用。同时酵素可抑制糖尿病小鼠血糖升高，在第28天与试验起始相比，阳性组和酵素高剂量组小鼠空腹血糖值比较差异没有统计学意义，尚不能认为它们在降血糖上有差异。同时酵素剂量组能降低II型糖尿病小鼠血清中TG、TC含量，说明酵素还具有调节II型糖尿病小鼠脂代谢的作用。

综上所述，酵素能抑制II型糖尿病小鼠血糖值的增加，降低血清中TG、TC含量。但有关酵素如何参与机体的血糖、血脂代谢，以及其分子层面更深入的降糖、降脂机理尚有待研究，本文也为其预防和治疗糖尿病及其并发症提供了试验和理论参考。

［1］板仓弘重.食用酵素食品预防生活习惯［J］.长春中医药大学学报，2006，22（4）:80

［2］Hideki Okada，Naoki Kawazoe，Akira Yamamori，et al．Structural analysis and synthesis of oligosaccha-rides isolated from fermented beverage of plant extract［J］．Journal of Applied Glycoscience，2008，55: 143-148

［3］于晓艳，任清，卢舒娴，等．微生物酵素主要功效酶活力的测定［J］．食品科技，2008（7）:193-196

［4］Nacci C，Tarquinio M，De B L，et al.Endothelial dysfunction in mice with streptozotocin-induced type 1 diabetes is opposed by compensatory overexpression of cyclooxygenase-2 in the vasculature［J］. Endocrinology，2009，150（2）:849-861

［5］Casellas A，Salavert A，Agudo J，et al.Expression of IGF-I in pancreatic islets prevents lymphocytic infiltration and protects mice from type 1 diabetes［J］.Diabetes，2006，55（12）:3246-3255

［6］闵筱辉，陈其奎，于涛，等.链脲佐菌素诱导建立长期稳定糖尿病小鼠模型的给药方案研究［J］.中国医药导报，2013，10（4）:7-10

Experimental Study of Model Mice on the Apple Enzyme of Metabolic Disease

MA Qiao-ling1，SHEN Yuan-ying1，2，*，YANG Fang1，GUO Le1，WANG Yun-hong1，LI Chao-nan2
（1.School of Public Health，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China；2.Pre-clinical College，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

To study on homemade apple enzyme with high fat diet and streptozotocin（Streptozotocin，STZ）to establish the mice models of type II diabetes mellitus hypoglycemic，lipid-lowering effect.The number of 70 two month's mice were randomly divided into normal group，type II diabetes mellitus model group enzyme treated group，enzyme and low dose treated group，enzyme and middle dose treated group，enzyme and high dose treated group，enzyme and high dose in 28 d．The capability of afsting blood glucose and blood lipid．The weight of mice was monitored every week．Food and drink of the mice were also observed in the cages.The afsting blood glucose level of type II diabetes mellitus model was obviously higher than that of normal group（p＜0.05）and steady．The glucose level of metformin treated group was decreased．The glucose level and blood lipid level of enzyme and high dose treated group were obvious difference．Compared with the model group，the levels of TC and TG in this group were lowered remarkably.Enzyme may be related to improving hypoglycemic and hypolipidemic effect in type II diabetes mellitus mice.

enzyme；type II diabetic；afsting blood glucose；blood lipid；animal model

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.004

2015-01-27

2014年度科学技术项目（2014SF11）

马巧灵（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：流行病与卫生统计学。