响应面法优化紫甘薯酒中花色苷含量

宋雪樊，李　楠，熊　伟，曾丽萍，邬应龙

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

响应面法优化紫甘薯酒中花色苷含量

宋雪樊，李楠，熊伟，曾丽萍，邬应龙*

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

以紫甘薯酒为研究对象，在单因素实验的基础上，应用Box-Behnken方法进行三因素三水平实验，以液料比、发酵初始pH和发酵温度为影响因素，花色苷含量为响应值，进行响应面分析。确定最佳发酵工艺条件为液料比1.4∶1，pH4.15，发酵温度24℃。在此条件下发酵，可得酒度为12.3°，花色苷含量为123.34mg/L的紫甘薯酒，花色苷含量与其理论值124.54mg/L接近，相对误差小于0.96%。结果表明，采用响应面分析法对紫甘薯酒中的花色苷含量进行优化合理可行，可为进一步研究提供依据。

花色苷，紫甘薯酒，响应面法，发酵

紫甘薯富含淀粉、水溶性膳食纤维、粗蛋白等营养元素，其最大的特点是富含花色苷色素［1］。紫甘薯花色苷主要组成成分是矢车菊素和芍药素，花色苷含量的测定是紫甘薯酒一项重要的理化指标［2］。花色苷具有清除自由基［3］、抗肿瘤［4］、抑菌［5］、降血糖［6］、保护肝功能［7］等生理功能，紫甘薯用作酿酒原料，花色苷会保留在酒液中，得到具有较强抗氧化活性的保健酒［8］。

研究表明，花色苷的稳定性受到pH、温度、光照等影响［9-10］。本实验在前期实验的基础上［11］，选择打浆液料比、初始pH和发酵温度作为单因素，花色苷含量为响应值，采用响应面法优化紫甘薯酒的酿造工艺条件，用以提高酒中花色苷含量，为紫甘薯酒的进一步开发提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蒸紫甘薯汉源紫甘薯酒厂提供；酵母菌118四川农业大学功能性实验室保藏；α-淀粉酶（酶活力＞3600U/g）、葡萄糖酶（酶活力＞105U/g）上海瑞丰生物有限公司；蔗糖太古炼糖厂有限公司；所用其他试剂均为分析纯。

BT-124S型电子天平北京赛多斯仪器系统有限公司；JOUANBR4i型恒温水浴锅上海光地仪器设备有限公司；UV-2101型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；打浆机美的电器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1紫甘薯酒的制作流程蒸紫甘薯→打浆→α-淀粉酶酶解液化→葡萄糖酶酶解糖化→调节pH→调节糖度→杀菌→加酿酒酵母→发酵7d→过滤→紫甘薯酒［12］。

1.2.2紫甘薯酒发酵过程中花色苷含量和酒度的变化规律探讨固定蒸紫甘薯打浆液料比为1.5∶1，酵母添加量1%，在α-淀粉酶添加量1%，液化温度90℃条件下液化1h，葡萄糖酶添加量1%，糖化温度65℃条件下糖化时间1h，调节初始pH4.0，调糖度至22°Bx，发酵温度24℃，发酵7d［13-14］。每天跟踪测量花色苷含量及酒度，探究它们在发酵过程中变化规律及在发酵结束时是否趋于稳定。

1.2.3发酵条件的单因素实验设计以发酵7d结束时酒中花色苷含量和酒度为指标，固定酵母添加量1%，在α-淀粉酶添加量1%，液化温度90℃，液化时间1h，葡萄糖酶添加量1%，糖化温度65℃，糖化时间1h，调糖度至22°Bx，发酵7d，分别考察液料比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1），初始pH（3、3.5、4、4.5、5），发酵温度（16、20、24、28、32℃）对花色苷含量及酒度的影响。

1.2.4响应面的实验设计在单因素实验分析的基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面设计方法［15-16］，选择液料比，初始发酵pH和发酵温度这3个因素进行响应面实验，以花色苷含量为指标进行优化，所有实验均重复3次。实验因素水平设计具体见表1。

表1　Box-Behnken响应面实验设计因素水平Table 1　Coded values and corresponding real values of fermentation conditions tested in Box-Behnken experimental design

1.3指标检测方法

1.3.1花色苷含量的检测方法采用pH示差法［17-18］，取1mL发酵酒液加入pH为1.0、4.5的缓冲液24mL，静置平衡60min后，以去离子水为空白，在520nm和700nm波长下测定吸光度。

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；

式中：A为由公式计算得的吸光度差值；Mw为矢车菊素葡萄糖苷的相对分子质量（449.2g/mol）；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（26900L/mol·cm）；Df为稀释因子（样品总的稀释倍数）；103为转换系数，g转换为mg。

1.3.2常规指标测定还原糖含量：GB/T 5009.7-2008，直接滴定法；pH：pH计直接测定；酒度：采用GB/T 5009.48-2003比重计法，以乙醇的体积分数计。

1.4数据的统计与分析

利用Origin 8.0软件对单因素实验的数据进行处理，并采用Design-Expert 7.0软件对响应面实验得到的数据进行线性回归和方差分析。

2　结果与分析

2.1发酵过程中花色苷含量和酒度的变化规律

由图1可知，在发酵初期酒精度上升明显，临近发酵结束时酒精度上升缓慢甚至不变。前期，由于花色苷的积累与酒精的浸渍作用，花色苷含量逐渐增大，在发酵第4d达到最大值；在发酵后期，随着糖分渐渐减少，酵母菌的老化会在某种程度上吸附一部分色素［19］，致使花色苷含量减少并逐步稳定。发酵结束时，酒度与花色苷含量均已趋于稳定。因此，采用发酵第7d的花色苷含量为指标进行单因素及响应面实验。

图1　发酵过程中花色苷含量随时间的变化Fig.1　Changes of the anthocyanin content of the time

2.2单因素实验结果与分析

2.2.1液料比对花色苷含量及酒度的影响从图2可知，花色苷含量与酒度在液料比为1.5∶1时均有最大值。当液料比为1∶1时，紫甘薯浆液成糊状，不利于花色苷的析出；随着加水量的增加，花色苷含量增加，在液料比为1.5∶1时达到最大值；后加水量继续增加，紫甘薯浆液的浓度降低，花色苷含量随之逐渐降低。因此，液料比选择1.5∶1为宜。

图2　液料比对花色苷含量的影响

2.2.2初始pH对花色苷含量及酒度的影响花色苷在酸性环境下较稳定，其稳定性随着碱度的增加而降低［9］；在pH为4.0时，花色苷的降解速度最慢［20］，具有最大的稳定性。由图3可知，花色苷含量随着pH的升高而升高，到达pH为4.0后，花色苷含量随着pH的增大而逐渐减小，这符合花色苷的理化性质。微酸性环境有利于酵母菌的生长和高级醇的形成［12］，酒度在pH为4.0时也有最大值。因此，发酵的初始pH以4.0为宜。

图3　发酵初始pH对花色苷含量的影响Fig.3　Effect of extraction pH on anthocyanin content of purple potato wine

2.2.3发酵温度对花色苷含量及酒度的影响从图4可以看出，当发酵温度为24℃时，酒中花色苷的含量和酒度都为最高。当温度小于24℃时，随着发酵温度的增加，花色苷的含量和酒度都逐渐升高；当温度大于24℃时，因花色苷的稳定性随着温度的升高而降低［20］，所以花色苷含量开始降低，且随着发酵温度的增加，酵母菌发酵速度快衰老快，酒度也随之下降。因此，发酵温度选择24℃最优。

图4　发酵温度对花色苷含量的影响Fig.4　Effect of extraction temperature on anthocyanin content of purple potato wine

2.3响应面法发酵条件的优化

2.3.1响应面实验设计及结果根据表1的实验编码表进行实验，表2是响应面实验设计及结果。

采用Design Expert 7.0软件对实验数据进行分析，得到二次回归方程如下：Y=122.39-7.13A+6.35B-5.48C+3.49AB-5.24AC+9.41BC-10.05A2-7.89B2-8.67C2。对表2实验结果进行统计分析，方差结果如表3所示。

从表3可知，该回归模型p＜0.0001，模型极显著，R2=0.9858，R2Adj=0.9676，说明模型与实际值拟合程度较好，建模成功；一次项A、B、C，交互项BC、AC及二次项A2、B2、C2极显著（p＜0.01），交互项AB显著（0.01＜p＜0.05），可用该回归模型对紫甘薯酒发酵工艺进行分析和预测。

表2　Box-Behnken实验设计及结果Table 2　Design and results of Box-Behnken experiment

表3　回归方程方差分析表Table 3　Analysis result of regression and variance

由自变量的F值可知各因素对花色苷含量的影响依次为：A＞B＞C，即液料比＞pH＞发酵温度。说明液料比对花色苷含量影响最大，其次为初始pH，发酵温度影响最小。

2.3.2交互作用分析经Design Expert软件分析可得到3个影响因子之间的响应面分析图，如图5所示。响应曲面坡度相对平缓，表示响应值可以忍受处理条件的变异；响应曲面坡度非常陡峭，表示响应值对于处理条件的改变非常敏感［21］。

由图5a可以看出，液料比与初始pH对花色苷含量的作用显著。当初始pH在3.8～4.0之间，液料比介于1.5～1.7时，花色苷含量可获得最大值。当pH小于3.8或大于4.0，液料比小于1.5或大于1.7时，花色苷含量较小。由图5b可知液料比与发酵温度作用极显著，花色苷含量随着液料比和发酵温度这两个编码值得变化而快速变化。当液料比在1.4～1.6之间，发酵温度在22～24℃之间时花色苷含量有最大值。液料比增加，含量有所增加，在高于1.4左右开始下降；温度下降，含量增加，在23℃左右时趋于平缓。从图5c可以看出，发酵温度与发酵初始pH对花色苷含量有极显著影响，两者在花色苷含量的提高中起到关键作用。当初始pH介于3.9～4.1之间，发酵温度在23～25℃时，花色苷含量可获得最大值，这与花色苷在低温酸性条件下较稳定的理化性质相符。

图5　两因素交互作用对提取效果的影响响应面图Fig.5　Response surface for the effect of two factors on extraction rate

2.3.3发酵工艺条件验证在上述响应面分析的结果确定的最佳工艺条件下，即液料比1.36∶1，初始pH4.15，发酵温度23.73℃，考虑到实际操作的便利，确定工艺条件为液料比1.4∶1，初始pH4.15，发酵温度24℃，做3组平行实验，得到花色苷含量的平均值为123.34mg/L，酒度为12.3°的紫甘薯酒。花色苷含量实际值与理论值124.54mg/L相对误差在±0.96%以内。

3　结论

紫甘薯酒中花色苷含量在随着发酵时间的延长而呈现上升趋势，在发酵第4d出现峰值，后缓慢下降，在发酵结束时趋于稳定；酒度随着发酵进行而逐渐上升，在发酵后期趋于稳定。发酵过程中各因素中对花色苷含量的影响顺序为：液料比＞初始pH＞发酵温度。响应面方法优化确定酒中花色苷含量最高的发酵条件为：打浆液料比1.4∶1，初始pH4.15，发酵温度24℃。在此条件下发酵，可得酒度为12.3°，花色苷含量为123.34mg/L的紫甘薯酒，花色苷含量与其理论值124.54mg/L相对误差为±0.96%以内，说明利用本实验建立的模型的优化结果与实际情况吻合。在优化的工艺条件下测得的花色苷含量达123.34mg/L，为紫甘薯酒的进一步研发提供重要参考依据。

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Optimization of anthocyanin content in purple potato wine by response surface analysis

SONG Xue-fan，LI Nan，XIONG Wei，ZENG Li-ping，WU Ying-long*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

With purple potato wine as the research object，the methods of single factor and response surface was used to maximize the anthocyanin content in the wine.A regression equation was established to obtain the optimal fermentation parameters.The optimal fermentation conditions were as follows:proportion of water and material 1.4∶1，pH4.15，and fermentation temperature 24℃.Under this optimal fermentation conditions，the purple potato wine of 12.3°with a anthocyanin content of 123.34mg/L was obtained and the anthocyanin content was close to the predicted value 124.54mg/L with a relative error less than 0.96%.Accordingly，response surface could be a reasonable and feasible approach to maximize the anthocyanin content in purple potato wine，providing the basis for further researche.

anthocyanin；purple potato wine；response surface analysis；fermentation

TS262.7

B

1002-0306（2015）10-0297-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.054

2014－08－18

宋雪樊（1992-），女，本科在读，研究方向：食品科学与工程。

邬应龙（1963-），男，博士，教授，研究方向：功能性食品、粮油加工。

四川省科技厅2014年科技富民强县项目。