基于SERS技术的脐橙果肉中三唑磷农药残留快速检测研究

王晓彬，曾海龙，吴瑞梅，刘木华，张庐陵，李俊杰，陈金印

（1.江西农业大学生物光电及应用重点实验室，江西南昌330045；2.江西省出入境检验检疫局技术中心，江西南昌330002；3.江西农业大学农学院，江西南昌330045）

基于SERS技术的脐橙果肉中三唑磷农药残留快速检测研究

王晓彬1，曾海龙2，吴瑞梅1，刘木华1，张庐陵1，李俊杰1，陈金印3，*

（1.江西农业大学生物光电及应用重点实验室，江西南昌330045；2.江西省出入境检验检疫局技术中心，江西南昌330002；3.江西农业大学农学院，江西南昌330045）

采用表面增强拉曼光谱（SERS）技术结合快速溶剂前处理方法建立脐橙果肉中三唑磷农药的快速检测方法。以脐橙果肉为空白对照，利用快速溶剂前处理方法对脐橙果肉进行提取，对不同浓度的以脐橙果肉提取液为基质的三唑磷溶液进行SERS检测。结果表明，以脐橙果肉提取液为基质的三唑磷溶液最低检测浓度为0.5mg/L；选择乙腈为内标物，以三唑磷1409cm-1特征峰与乙腈2257cm-1特征峰强度比值作为相对强度，其相对强度与三唑磷溶液浓度在0.5～20mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（R2）为0.9919；预测误差在0.12mg/L以下，预测回收率为98.1%～102.5%，说明模型具有较好的预测效果，本文所建立的方法是准确可靠的。

脐橙果肉，三唑磷农药，表面增强拉曼光谱，快速检测

三唑磷（triazophos）是一种中毒广谱有机磷杀虫剂，具有强烈的触杀和胃毒作用，主要用于防治果树、粮食作物和棉花上的鳞翅目害虫、害螨等［1］。三唑磷随食物进入人体后，会造成大量乙酰胆碱蓄积在神经效应器接点处，发生毒蕈碱样、烟碱样及中枢神经系统症状［2］。目前三唑磷农药的常规检测方法有气相色谱法［3］、超高效液相色谱-串联质谱法［4］等，但样品前处理过程耗时长、检测速度慢，不适于现场实时检测。

表面增强拉曼光谱（Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）是指将待测物分子吸附在特殊制备的金属材料（如金、银等）表面或溶胶中，激光照射到吸附有金、银颗粒的待测试样时，金属表面电场会增强，使待测物拉曼信号能增强104～1010倍［5-7］。SERS技术具有样品制备简单、检测速度快、灵敏度高等优点，能实现对微量样品的快速检测，在农药残留的检测中有较好的应用潜力［8-10］。刘燕德等［11］利用共焦显微拉曼光谱技术分析了脐橙表皮的乐果农药残留，建立了脐橙表皮的乐果农药残留的预测模型。Shetan等［12］利用固相萃取技术对橙汁进行前处理，获取含甲基毒死蜱农药的提取液，结合SERS技术，检测最低浓度为50μg/kg。He等［13］利用表面拭子捕获方法，结合SERS技术，定量检测了苹果表面的噻菌灵农药残留，回收率为89.2%～115.4%。Li等［14］应用SERS技术检测苹果表皮甲拌磷和倍硫磷农药残留，甲拌磷检测最低浓度为0.05mg/L，倍硫磷检测最低浓度为0.4mg/L。上述方法使用表面增强拉曼光谱技术能达到对水果中农药分子信号增强的目的，但前处理过程复杂、耗时长，要实现快速检测其方法还需进一步改善。

采用SERS技术结合商业化的金纳米增强试剂对脐橙果肉中三唑磷农药残留进行快速检测。以气相色谱串联质谱方法未检测出三唑磷农药的脐橙为研究对象，利用快速溶剂提取前处理方法对脐橙果肉进行提取，采用N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳去除有机酸、色素等物质的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

97.2%三唑磷Sigma-Aldrich公司；色谱纯乙腈、无水硫酸镁和氯化钠国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺和C18北京迪马科技有限公司；石墨化碳天津博纳艾杰尔科技有限公司；0.22um有机系滤膜美国Agilent公司；OTR202和103纳米增强试剂苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司；脐橙赣州大余脐橙基地；含农药脐橙江西出入境检验检疫局。

RamTracer-200-HS高灵敏度激光拉曼光谱仪苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司；Agilent GC 700B型三重四极杆气相色谱串联质谱仪美国安捷伦科技有限公司；JW1024型低速离心机安徽嘉文仪器设备有限公司；BL25C33型搅拌机佛山美的集团股份有限公司；VORTEX-5型旋涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；FA1004B型电子天平上海上平仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1三唑磷标准溶液的配制称取2mg三唑磷标准品，用适量乙腈溶于100mL棕色容量瓶中，超声溶解后，用乙腈定容至刻度，得到浓度为20mg/L的三唑磷标准储备液。

1.2.2气相色谱串联质谱实验条件色谱柱：HP-5MS 30m×0.25mm×0.25μm石英毛细管柱；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度为150℃，保持2min；以25℃/min升至280℃，保持2min；升至300℃，保持2min（后运行）；载气：氦气（纯度≥99.999%）；载气流速：1.2mL/min；进样量：1μL；进样方式：不分流进样。离子源：EI源；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；碰撞气：氮气（纯度≥99.999%）；采集模式：多反应监测模式（MRM）。

1.2.3以脐橙果肉提取液为基质的三唑磷溶液配制a.采用经气相色谱串联质谱检测无农药残留的新鲜脐橙，去皮后将其可食用部分切碎，放入BL25C33型搅拌机将样品加工成浆状，备用。b.称取10g果肉样品于50mL离心管中，依次加入10mL乙腈、4g无水硫酸镁和1g氯化钠，摇匀后在400r/min的涡旋混合器上混合2min后，4200r/min的速度离心5min，此时上清液为黄色。c.取上述黄色上清液4mL放于装有适量无水硫酸镁、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳的15mL离心管中，摇匀后在400r/min的涡旋混合器上混合2min，以4200r/min的速度离心5min，得到无色的上清液，无色上清液中去除了有机酸、色素等基质的影响。d.用步骤c的过滤液为基质，分别配制不同浓度（20、15、12、10、8、6、4、2、1、0.8、0.6mg/L和0.5mg/L）的三唑磷溶液，进行拉曼光谱检测。

1.2.4数据采集向2mL进样瓶中依次加入500μL OTR202试剂、20μL待测溶液和100μL OTR103试剂，混合均匀后放入样品池中采集拉曼信号。拉曼光谱系统采用785nm的激光波长，激光光源功率为200mW，光学分辨率4cm-1，拉曼光谱采集范围为300～2400cm-1，积分时间10s，积分2次取平均。

图1 拉曼光谱图Fig.1　Raman spectrum.

2　结果与分析

2.1三唑磷标准溶液的普通拉曼光谱与表面增强拉曼光谱

图1（a）为乙腈溶液的普通拉曼光谱，图1（b）和（c）分别是浓度为20mg/L三唑磷标准溶液的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱。从图1可看出，三唑磷乙腈溶液的普通拉曼光谱（b）和乙腈溶液的拉曼光谱（a）基本一致，说明在三唑磷标准溶液的普通拉曼光谱中未出现三唑磷农药的拉曼信号。而三唑磷标准溶液的SERS（c）的拉曼谱峰明显且谱峰强度高，说明表面增强试剂OTR202和OTR103能有效增强三唑磷的拉曼信号。图中611、977、1000、1330、1407、1595cm-1处拉曼信号明显，其中1407cm-1处强度最高，主要由三唑磷结构中三唑环上C-N伸缩振动引起，另外还伴随有—CH3/CH2/CH弯曲振动；977、1000、1330cm-1峰强次之，977cm-1为C-N-N和苯环的弯曲振动，1000cm-1由苯环的呼吸振动引起，1330cm-1归属于C-N伸缩振动；611cm-1主要由C-O-P弯曲振动引起，伴有整个骨架的振动；1595cm-1归属于苯环上C=C伸缩振动［15-16］。这些特征峰可作为三唑磷农药的定性定量判别依据。

2.2以果肉提取液为基质的三唑磷溶液的SERS分析

图2为不同浓度以脐橙果肉提取液为基质的三唑磷溶液的表面增强拉曼光谱。对比图1和图2，浓度为2mg/L时，三唑磷的6处拉曼峰明显，易识别；浓度为1mg/L时，609cm-1处的拉曼特征峰已不容易识别，其他5处拉曼特征峰峰强明显降低，但依然能识别出；浓度为0.6mg/L时，999cm-1和1409cm-1两处特征峰可识别但峰强较低；浓度为0.5mg/L时，1409cm-1处特征峰不易识别，但其依然存在，峰强十分微弱；浓度为0.4mg/L时，未出现三唑磷农药的特征拉曼峰。由此表明，利用表面增强拉曼光谱技术检测到脐橙果肉中三唑磷农药的最低浓度为0.5mg/L。文献［12］初步采用拉曼光谱技术检测橙汁中甲基毒死蜱农药残留，其最低检测浓度为0.05mg/kg，前处理过程为12min，但该文献只对橙汁中农药残留检测做了定性判别，方法的准确性未进一步验证。

图2　不同浓度以果肉提取液为基质的三唑磷溶液的表面增强拉曼光谱Fig.2　Different SERS spectra of triazophos solutions with flesh extract as the matrix

2.3以果肉提取液为基质的三唑磷溶液的定量分析

在前面分析的基础上，本文进一步建立脐橙果肉中三唑磷农药残留定量分析模型。因光源输出功率的稳定性、检测元件的暗电流以及样品浓度不同等因素会引起拉曼散射指数不同，这些因素会影响检测结果的准确性。因此，必须选择一个适当的内标物以相对强度的方式来最大可能地消除外界因素的影响［18］。本文选用2257cm-1处乙腈C≡N伸缩振动峰为内标峰，这是因为2257cm-1处拉曼峰较稳定且与三唑磷的特征峰不重合，另外采用乙腈为内标物可避免因加入其他试剂对待测溶液产生干扰。

在以果肉提取液为基质的三唑磷溶液的拉曼特征峰中，1409cm-1归属于三唑环上C-N伸缩振动，没有重叠峰的影响，因此选用该特征峰作为定量峰，将1409cm-1特征峰强度（It）与乙腈在2257cm-1特征峰强度（Ia）的比值作为相对强度IR=It/Ia，以相对强度作为不同浓度以果肉提取液为基质的三唑磷溶液的响应值进行线性回归，发现相对强度IR与其浓度具有良好的线性关系，如图3所示，线性范围为0.5～20mg/L，线性方程为y=0.3434x+2.1008，相关系数R2=0.9919。

图3　以果肉提取液为基质的三唑磷溶液标准曲线Fig.3　Standard curve of triazophos solutions with flesh extract as the matrix

2.4预测模型的分析结果和评价

为检验方法的准确性，采用江西出入境检验检疫局含三唑磷农药的脐橙样本进行检测。图4（A）为脐橙果肉阴性基质的色谱图，图4（B）为含三唑磷农药脐橙果肉样品的色谱图，由图可以看出，三唑磷农药的保留时间为7.779min。

图4　A-脐橙果肉基质色谱图；B-含三唑磷农药脐橙果肉样品色谱图Fig.4　Gas chromatogram：A-matrix of navel orange flesh；B-Navel orange flesh containing pesticides

对4个含三唑磷农药的脐橙果肉样本进行前处理，采集6次拉曼信号取平均，采用标准曲线模型对样本进行预测，并与标准化学方法测定结果进行比较，结果见表1。由表1可知，本方法的检测结果与标准方法基本一致，4个脐橙果肉样本中三唑磷农药的预测值与实际测量值的差值为-0.05～0.119，预测回收率为98.1%～102.5%，说明该方法能初步达到脐橙果肉中三唑磷农药残留快速筛查的目的。

表1　脐橙果肉中三唑磷农药的预测值与真实值比较Table 1　Predicted value and measured value of triazophos in flesh of navel orange

3　结论

采用快速溶剂提取前处理方法和表面增强拉曼光谱技术快速检测脐橙果肉中三唑磷农药残留，找到了三唑磷农药的6处拉曼特征峰，这些特征峰可作为三唑磷农药的定性定量判别依据，该方法对脐橙果肉中三唑磷农药的最低检测浓度为0.5mg/L。以乙腈2257cm-1处特征峰为内标峰，以三唑磷1409cm-1特征峰与乙腈2257cm-1特征峰强度比值作为相对强度，建立了脐橙果内中三唑磷农药的定量分析模型，模型在0.5～20mg/L范围内具有良好的线性关系。用4个含三唑磷农药残留的样本对方法的准确性进行验证，结果显示本方法的检测结果与标准方法基本一致。本方法整个前处理过程在15min内完成，检测成本低，为脐橙中农药残留的现场实时快速检测提供了方法支持，研究方法和思路能为农产品中其他农药的拉曼光谱快速检测提供参考。

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Study on rapid detection of triazophos residues in flesh of navel orange by SERS

WANG Xiao-bin1，ZENG Hai-long2，WU Rui-mei1，LIU Mu-hua1，ZHANG Lu-ling1，LI Jun-jie1，CHEN Jin-yin3，*
（1.Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Entry-Exit Inspection and Quarantine，Jiangxi Province，Nanchang 330002，China；3.College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

The rapid detection method of triazophos residues in flesh of navel orange was reported in this paper. Flesh of navel orange was obtained using quick pre-treatment method.SERS of different concentration of triazophos solutions with flesh extract as the matrix were collected by laser Raman spectrometer.The results showed that minimum detection concentration for triazophos in navel orange was 0.5mg/L.Acetonitrile was selected as the internal standard and the relative intensity was made by characteristic peak（1409cm-1）of triazophos and characteristic peak（2257cm-1）of acetonitrile.A good linear relationship was found between the relative intensity and concentration of triazophos in the range of 0.5～20mg/L，with a good correlation coefficient（R2）of 0.9919.The predict recoveries were 98.1%～102.5%and the predicted deviations were below 0.12mg/L. This study demonstrates that this method was accurate and reliable.

flesh of navel orange；triazophos；surface-enhanced raman spectroscopy；rapid detection

TS207.7

A

1002-0306（2015）10-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.008

2014－09－10

王晓彬（1989－），男，硕士研究生，研究方向：农产品品质光学无损检测。

陈金印（1962-），男，博士，教授，研究方向：果实采后生理。

赣鄱英才555工程人选计划；国家自然科学基金项目（31271612）；江西省学术带头人培养计划（20113BCB22001）。