宁夏清真手抓羊肉特征指纹图谱的构建

张同刚，曲云卿，刘雨杨，王　旭，刘敦华

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

宁夏清真手抓羊肉特征指纹图谱的构建

张同刚，曲云卿，刘雨杨，王旭，刘敦华*

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

采用气-质联用技术（GC-MS）建立手抓羊肉风味特征指纹图谱，为手抓羊肉品质评定、原料判断提供一种新方法。以不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉为研究对象，选取色谱图中的特征峰，构建不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉风味特征指纹图谱；通过夹角余弦法计算样品与指纹图谱相似度，并对其聚类分析。结果表明，手抓羊肉香味指纹图谱稳定性好，相似度高，具有较强的特征性和唯一性。该图谱能综合、准确地反映手抓羊肉的风味情况，为评价手抓羊肉品质评价提供一种新的思路方法。

手抓羊肉，气相色谱-质谱，指纹图谱，聚类分析

清真手抓羊肉是最具宁夏特色的著名小吃之一，具有鲜、香、嫩3个特色，有100多年的历史。过去因民间多在沿街摊点出售，顾客常以手抓食之，故得名［1］。羊肉具有很高的营养价值和经济效益［2］，且不存在宗教和文化的禁忌，已经被越来越多的人所接受和喜爱［3］。

当前，评价羊肉产品品质的方法主要有传统的感官评定和基于现代分析技术的品质指标分析法［4］。前者受主观因素影响较大；后者得出结果时间长且步骤繁琐，也不能准确全面地反映出手抓羊肉真实的品质。指纹图谱技术是通过对图谱分析，提取能反映其整体特性的特征图谱，具有“整体性”、“特征性”［5］等特点，很大程度上弥补人工感官评价和品质指标分析法的不足。其在国内外得到较广泛的研究与应用，如植物有效成分分析等方面［6-8］。羊肉及其产品中发现的挥发性成分有300余种，包括羧酸类、醛类、酯类、醇类和杂环化合物等，如2-戊基呋喃、5-硫甲基糠醛、2-甲基-环戊酮、壬醇、乙酸乙酯、辛醛等。它们的含量很低，但阈值也较低，对羊肉及其产品特征风味的形成起到了决定作用［9］。

本研究采用SPME-GC-MS技术对手抓羊肉样品进行分析，结合Kovats值（KI）和相关文献，确定其主体香气成分，并采用系统聚类和相似度分析法构建手抓羊肉香气指纹图谱。使之与传统感官评价相结合，应用于产品质量及稳定性的评测。为今后宁夏手抓羊肉产品的开发、生产工艺的控制、风味物质的研究和品质评价等方面提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

食盐、大葱、生姜、大料等宁夏回族自治区银川市新百超市宁阳店；1～6号为6月龄小尾寒羊前腿肉（已排酸），7～12号为1岁小尾寒羊前腿肉（已排酸），13～18号为2岁小尾寒羊前腿肉（已排酸）宁夏回族自治区银川市新百超市宁阳店。

萃取头65μm PDMS/DVB，美国Supelco公司；JJ-2（2003-61）型气相色谱-质谱联用仪日本岛津公司；HH.SY21-Ni6-C型高速组织捣碎机江苏金坛市亿通电子有限公司。

1.2实验方法

1.2.1手抓羊肉生产工艺原料肉→分割（4cm×10cm）→浸泡→预煮（撇沫）→煮制→冷却→切块→成品。

1.2.2手抓羊肉挥发性风味物质的提取

1.2.2.1样品预处理将按照最佳工艺：浸泡时间17min，煮制时间70min，食盐添加量为3.50%，香辛料添加量为0.20%制备的手抓羊肉样品放入高速组织捣碎机中制成糜状待用。

1.2.2.2固相微萃取根据文献［10］，修改如下：加3g样品到20mL顶空瓶中，再加0.6g氯化钠，混匀，将其放入水浴锅中60℃恒温加热30min，然后将已老化好的SPME针头插人顶空瓶中萃取。30min后将萃取头拔出，再插入到GC/MS进样器中，解吸5min，收回纤维头，拔出萃取头。

1.2.3手抓羊肉挥发性风味物质的检测

1.2.3.1色谱条件根据文献［10］，修改如下：DB-5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.5μm；Agilent Technologies），载气为He，恒定流速为3.7mL/min，不分流模式；进样口温度为250℃，FID检测器温度为250℃，柱初温为50℃，保持2min，以15℃/min升温到100℃，然后再以5℃/min升温到220℃，保持 10min，之后以10℃/min升温到260℃，最后以5℃/min升温到280℃。

1.2.3.2质谱条件色谱-质谱接口温度250℃，谱库NIST05a.L。质谱质量扫描范围为20～450amu。

1.2.3.3KI值测定对于风味物质的分析和鉴定，一般采用GC-MS技术，并通过检测NIST质谱库，从而方便快速的得出结果。但由于挥发性组分的复杂性，以及色谱条件的差异对实验结果的影响，经常导致检索结果的不准确，或者出现一个组分得出多个结果的情况。从而导致定性困难，甚至有时会出现错误。因此，本实验采用KI保留指数作为辅助手段，缩小检索范围，对质谱结果进行进一步认证［11］。

1.3峰的相对保留时间与相对峰面积计算公式

相对保留时间计算公式：a=ti/tr（其中ti为待测峰保留时间，tr为参考峰保留时间）

相对峰面积计算公式：S=Si/Sr（其中Si为待测峰峰面积，Sr为参考峰峰面积）

1.4数据分析

选择3组不同年龄的小尾寒羊，每组包括6个年龄相同、批次不同的样品，共计18个样品，采用SPMEGC-MS分别对18个小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉样品的挥发性风味物质进行分析，并将各色谱峰的峰面积与样品号建立矩阵，用分析软件SPSS 13.0对样品进行系统聚类分析，它是聚类分析中最为常用的一种无监督模式识别方法［12］，其原理是起始时n个样本自为一体，然后按照样本间相似性进行合并，最终所有样品归为一类［13］。

图1　6月龄小尾寒羊手抓羊肉挥发性成分总离子流图Fig.1　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 6-month-old sheep production

图2　1岁小尾寒羊手抓羊肉挥发性成分总离子流图Fig.2　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 1-year-old sheep production

2　结果与分析

2.1特征指纹图谱的建立

2.1.1特征值提取采用SPME与GC-MS联用，分析三组样品中的挥发性风味物质，检索出部分匹配率较高的物质，得到总离子流图1～图3。其中图1为6月龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉挥发性风味成分总离子流图，图2与图3分别为1岁、2岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉挥发性风味成分总离子流图。由图可知，相同年龄的小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在风味物质与相对含量上，相差不多；不同年龄的小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在风味物质种类上变化较小，而相对含量则变化明显。因此，根据挥发性风味物质相对含量的变化，可以构建不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉风味特征指纹图谱。由总离子流图可得，色谱峰较多且分布比较集中。从图1～图3中选取峰面积占总峰面积大于1%的峰作为共有峰，分别得到了18、20和21个共有峰。在总离子流图中选择一个特定的色谱峰，其保留时间在21.36min左右，位于色谱图较中心的位置、峰面积较大且分离度较好，并为所有样品所共有，作为参考峰。经GC-MS分析可得，该峰所代表的化合物为己醛。以共有峰与参考峰的相对保留时间、相对峰面积作为手抓羊肉指纹图谱的特征值。

2.1.2特征指纹图谱把特征峰相对保留时间t、相对峰面积S的平均值建立手抓羊肉3个不同年龄小尾寒羊的特征指纹图谱，见表1。

由表1可知，3个不同年龄小尾寒羊的特征指纹图谱的共有峰为8个；1岁小尾寒羊和2岁小尾寒羊的共有峰较多，为15个；而6月龄小尾寒羊与1岁小尾寒羊、2岁小尾寒羊的共有峰较少，分别为10、11个。

参考已报道的相关文献，去除了对于手抓羊肉风味贡献较低的化合物（如烃类物质，它们具有较高的风味阈值，对于产品风味几乎没有贡献），共挑选出27种手抓羊肉挥发性成分的风味物质，来建立宁夏清真手抓羊肉特征风味指纹图谱。本实验选用1，2-二氯苯作为内标添加参考物，根据被测化合物和内标物相应的色谱峰面积之比，来计算各物质的相对含量；通过GC-MS对上述提取的风味物质进行测定，并结合Kovats（KI）值和相关文献，确定其主体香气成分。所确定的27个共有峰为手抓羊肉特征风味的判别及其质量评价提供重要依据，可成为羊肉品质认证的有效手段与方法。

图3　2岁小尾寒羊手抓羊肉挥发性成分总离子流图Fig.3　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 2-year-old sheep production

表1　手抓羊肉特征指纹图谱数据Table 1　The fingerprints data of hand-grabbed lamb

由表1可知，在以上选定的27种香气活性物质中，包括10种醛、4种醇、2种呋喃、3种酮、3种羧酸、1种吡嗪和4种酯类，其中有4种物质已经被确认为对羊肉风味起决定性作用的特征风味物质［14］，如2-十一烯醛具有煮肉味和脂肪香、4-乙基辛酸具有干酪味和煮羊肉味道、4-甲基壬酸具有羊脂味和烤羊肉香味。

2.2方法学考察

2.2.1精确性实验选取1号样品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的条件连续进样5次。结果表明，特征峰的相对保留时间RSD均小于4%，且特征峰的相对峰面积的RSD均小于5%。进一步表明了固相微萃取与气相色谱-质谱法检测具有较好的精确性，符合指纹图谱的检测要求。

2.2.2重复性实验选取1～6号样品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的条件分6次进样。结果表明，特征峰的相对保留时间RSD均小于3.0%，且特征峰的相对峰面积RSD均小于5.0%。表明固相微萃取与气相色谱-质谱法检测具有较好的重复性，符合指纹图谱的检测要求。

2.2.3稳定性实验选取1号样品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的条件分6次分别在0、2、4、8、12、24h进样。结果表明，特征峰的相对保留时间RSD均小于3.0%，且特征峰的相对峰面积RSD均小于5.0%。表明固相微萃取与气相色谱-质谱法检测具有较好的稳定性，符合指纹图谱的检测要求。

2.3相似度分析

程翼宇等指出，夹角余弦法对色谱峰比值的差异具有较强的检测能力［15］。夹角余弦法［16］计算出的18个样品同手抓羊肉3个不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉挥发性风味成分特征指纹图谱相似度，计算结果如表2所示。

由表2可得，各样品与同年份小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱相似度均在99%以上，而与不同年份小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱相似度较低，其中6月龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉样品与2岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱相似度特征指纹图谱相似度分别低于0.56，1岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱与6月龄、2岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉样品相似度稍高，介于0.79～0.82之间。由相似度可得，6月龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉与2岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在风味物质方面区别较为明显，1岁小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉风味品质介于6月龄与2岁之间。说明小尾寒羊肉中蛋白质、脂肪等随着年龄的增长，逐步发生变化，其风味物质亦随着年龄的变化发生有规律的变化。因此，选择相似度为90%，作为样品质量稳定性的评判标准，与特征指纹图谱标准符合。能较准确地反映样品的香味质量情况。

表2　样品与特征指纹图谱相似度Table 2　The similarity between the sample and the fingerprints

2.4聚类分析

手抓羊肉特征香气指纹图谱的构建旨在为手抓羊肉样品的识别和质量控制提供有效手段。因为羊年龄与批次上不同，会使其挥发性风味物质的组成与含量存在相应的差异，同样如果手抓羊肉样品本身存在质量上的问题，也会对特征香气指纹图谱的构建带来影响。为构建较为稳定的手抓羊肉特征香气指纹图谱，从而得到较为标准化的特征香气指纹图谱信息。

图4　手抓羊肉聚类分析树状图Fig.4　The cluster analysis tree of hand-grabbed lamb

采用最远距离法系统聚类，得到聚类分析树状图，获得手抓羊肉特征挥发性风味物质的聚类谱系图，其中纵坐标为样品编号，横坐标为距离。聚类分析结果由树状图表示，见图4。由图4可知，18个样品可以分为3类，不同年龄样品各为一类，与实际情况相吻合，说明通过对特征峰的系统聚类分析，可以基本反映不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉风味特征，从而有效的对其分类。

3　结论

基于指纹图谱技术，采用GC-MS技术建立了不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉风味指纹图谱。样品与相同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱相似度较高，而与其他年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指纹图谱相似度较低，不同年龄的样品之间相似度均发生了较大变化，表明产品质量亦产生了较大波动，可以利用相似度来对手抓羊肉产品质量的稳定性进行判断。

对18个样品进行系统聚类分析，不同年龄的样品能很好的分类。说明，采用指纹图谱技术对不同年龄小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉进行品质评定、原料判断是可行的。

因此，利用气相色谱-质谱指纹图谱技术对于手抓羊肉风味具有较强的综合评价能力。当然，目前还缺少一个综合的评价指标，今后的研究重点在于尽可能将图谱的所有特征信息有机地统一起来，实现对指纹图谱更准确的判断，从而为评定食品风味品质方法提供新的思路，改变传统的依靠感官评价的单一方法。为手抓羊肉行业现代化的生产加工与监管部门对市场上手抓羊肉产品品质监管提供了一种新的方法。

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Establishment of halal hand-grabbed lamb of ningxia characteristic flavor fingerprint

ZHANG Tong-gang，QU Yun-qing，LIU Yu-yang，WANG Xu，LIU Dun-hua*
（1.College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

A novel approach was established for assessing quality of hand-grabbed lamb and determining the raw materials by using gas chromatography-mass spectrometry techniques to establish flavor characteristic fingerprint of hand-grabbed lamb.Different sheep of different ages production were selected as the research object，and the chromatogram peaks were selected from the chromatogram to build different sheep of different ages production flavor characteristic fingerprint；the similarity of samples and fingerprints was calculated by the cosine method，and analyzed the clustering.The results showed that the gas chromatographic fingerprint of hand-grabbed lamb aroma samples had fine stability，high similarity，greater characteristic and uniqueness.It could generally and exactly reflect the quality of hand-grabbed lamb aroma and become one effective method which could be used to evaluate the quality of them to some extent.

hand-grabbed lamb；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；fingerprint；clustering analysis

TS251.6

A

1002-0306（2015）10-0078-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.007

2014－07－07

张同刚（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。

刘敦华（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品科学及食品质量与安全。