响应曲面法优化紫薯中花色苷类物质的提取及抗氧化活性研究

杨　阳，张　鑫，吴祖芳，翁佩芳

（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

响应曲面法优化紫薯中花色苷类物质的提取及抗氧化活性研究

杨阳，张鑫*，吴祖芳，翁佩芳

（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

以紫薯为原料，利用热水提取紫薯花色苷，以提取物中紫薯花色苷的含量和抗氧化活性作为衡量提取工艺的指标，并利用响应曲面法进行实验设计及工艺参数优化。结果表明：紫薯花色苷的最佳提取条件为柠檬酸质量分数3%，提取温度63℃，提取时间2h，液料比为40∶1mL/g。在此条件下紫薯花色苷的含量可达7.21mg/g，同时抗氧化活性（IC50值）为123.93μg/mL。该提取方法准确、可靠，可用于紫薯中花色苷类物质的提取，同时提取物具有最强的抗氧化活性。

响应曲面法，紫薯，花色苷，提取，抗氧化能力

紫薯在世界范围内深受人们的喜爱，除了脍炙人口的色、香、味之外，流行病学与预防医学研究表明紫薯不仅具有比普通甘薯含量更高的营养成分，而且具有比普通甘薯更强的生物活性，如抗氧化、抑制肿瘤、免疫调节等生理功效［1-3］。紫薯含有多种人体必需营养物质，除淀粉和可溶性糖之外，还含有蛋白质及维生素、氨基酸等物质，营养价值很高。此外，紫薯还富含具有较强生理活性的花色苷。研究发现，紫薯的风味与保健功能正是其特有的花色苷等具有生物活性的成分所赋予的［4-5］。

紫薯中含有大量花色素类化合物，所以其根呈鲜艳的紫红色。紫薯中的花色素（Anthocyanidin）主要成分有两种，分别是矢车菊色素（Cyanidin，Cy）和芍药色素（Peonidin，Pn）（图1）［6］。由于花青素有多个酚羟基存在，导致其不太稳定，常与一个或多个糖分子通过糖苷键形成糖苷衍生物-花色苷（Anthocyanin）［7］。国内外诸多研究证明，从紫薯的的块根中浸提的花色苷类物质具有抗氧化、抗发炎、抗肿瘤、保肝护肝、抗动脉粥样硬化等多种功效，是值得进一步开发利用的资源［8-10］。

从天然植物中提取花色苷的主要方法包括溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法等［11-13］。目前，已经有紫薯花色苷提取工艺的优化研究［14-15］，但是还不够系统。本实验以紫薯为原料，将提取物的花色苷含量以及抗氧化能力作为响应值，利用响应曲面法对紫薯生物活性物质的提取工艺进行探讨，旨在得到最优工艺条件，为紫薯资源的开发利用提供参考。

图1　紫薯花色素主要成分Fig.1　The main components of sweet purple potato anthocyanidin

1　材料与方法

1.1材料与仪器

紫薯宁波当地市场；2，2-二苯代苦味酰基（DPPH）、氯化矢车菊色素标准物质美国Sigma公司；柠檬酸、无水乙醇、无水碳酸钠、福林酚试剂国药集团化学试剂有限公司；所用其他试剂均为分析纯。

AY-120型电子天平日本Shimadzu公司；TGL-16G型台式离心机上海安亭飞鸽公司；Scientz-18N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅国华电器有限公司；UV-3300型扫描型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1紫薯花色苷的提取将新鲜紫薯样品洗净，切成3～4mm薄片，真空冷冻干燥48h后过0.45mm筛，得紫薯粉末。称取1.0g样品，以40∶1的液料比加入3%柠檬酸水溶液，振荡混匀，60℃水浴浸提2.0h，4500r/min下离心15min，即得紫薯多酚粗提液。采用控制变量法分别研究柠檬酸质量分数（2%、3%、4%、5%、6%）、提取温度（40、50、60、70、80℃）、提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h）以及液料比（30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1）对紫薯提取物中花色苷含量，以及提取物抗氧化能力的影响。

1.2.2紫薯花色苷含量的测定紫薯花色苷含量测定采用Folin-Ciocalteu法［16］。取0.5mL样品液（适当稀释）与1.0mL的Folin-Ciocalteu试剂混匀，静置5min，加入2.0mL饱和Na2CO3溶液，30℃水浴反应1h，冷却后测定反应液在765nm处吸光值。同时配制浓度范围为1.0～10.0μg/mL的氯化矢车菊色素标准溶液，以蒸馏水为空白，于765nm处测定吸光度，测得的结果以氯化矢车菊色素标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准工作曲线。紫薯花色苷含量为每克紫薯原料中所含花色苷的量（以氯化矢车菊色素计，mg/g）。

1.2.3抗氧化能力的测定抗氧化能力的测定参照Leong等［17］的方法。称取适量DPPH，以无水乙醇定容得0.1mmol/L的溶液。取此溶液3mL加入不同质量浓度的样品液1mL，在室温下反应30min，517nm处测其吸光度，以1mL无水乙醇代替样品液作为空白，并按下式计算清除率：

DPPH自由基清除率（%）=（1-A试样/A空白）×100

式中：A试样为粗提液样品的吸光度，A空白为空白组的吸光度。

IC50值为在517nm处，DPPH自由基清除率达到50%时所需的样品浓度。

1.3响应曲面实验设计与数据分析

紫薯中花色苷的提取优化采用中心组合设计（CCD）进行，根据前期实验，以及花色苷类物质提取的研究报道，选取柠檬酸质量分数（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）3个因素为自变量，花色苷含量和抗氧化能力（IC50值）为响应值，实验自变量因素编码及水平见表1。

表1　中心组合设计实验自变量因素与水平Table 1　Fraction and levels of central composite design

1.4数据处理

利用统计软件Design-Expert 7.1.6进行实验设计与数据分析。所有实验值都是3次实验的平均值，数据以“平均值±标准差”表示。

2　结果与分析

2.1紫薯中花色苷提取工艺模型的建立及其显著性检验

2.1.1标准工作曲线的绘制以氯化矢车菊色素标准溶液浓度为横坐标，反应液的吸光值为纵坐标，绘制标准工作曲线。经过计算，得到的拟合回归方程为：y=0.1183x+0.0513，相关系数R2=0.999，表明氯化矢车菊色素在质量浓度为1.0～10.0μg/mL范围内与其吸光度呈良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，可以用此公式计算紫薯中花色苷类物质的含量。

2.1.2柠檬酸质量分数对紫薯花色苷含量和紫薯提取物抗氧化能力的影响由图2可知，提取物中紫薯花色苷的含量随着柠檬酸质量分数的升高而增加，当柠檬酸质量分数达到3%时紫薯花色苷的含量达到最大值，之后开始下降，而且紫薯花色苷的含量在柠檬酸质量分数为3%时，与其他质量分数差异显著（p＜0.05）。紫薯花色苷在酸性环境下比较稳定，而且紫薯花色苷的结构受pH的影响很大［18］。因此，在响应面实验设计时选择柠檬酸质量分数的适宜范围为2%～4%。

由图2可知，紫薯提取物的抗氧化能力随着柠檬酸质量分数的升高而逐渐增强，当柠檬酸质量分数达到3%时达到最大值，而在柠檬酸质量分数2%、3%和4%的情况下差异显著（p＜0.05），在4%、5%和6%的情况下差异不显著（p＞0.05）。因此，在响应面实验设计时，柠檬酸质量分数的适宜范围为2%～4%。

2.1.3提取温度对紫薯花色苷含量和紫薯提取物抗氧化能力的影响由图3可知，提取物紫薯花色苷含量随着提取温度的升高而逐渐增加，当温度达到60℃时紫薯花色苷的含量达到最大值，之后随着提取温度的升高而逐渐降低，且紫薯花色苷的含量在50、60、70℃之间差异显著（p＜0.05），可能由于紫薯花色苷是热敏感物质，在一定温度范围内随着温度升高有利于其从植物细胞中释放，而超过一定温度后结构会受到破坏，导致含量降低［19-20］。因此在实验选择的水平范围内，提取温度适宜范围为50～70℃。

图2　柠檬酸质量分数对紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影响Fig.2　Effect of citric acid mass fraction on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

图3　提取温度对紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

由图3可知，紫薯提取物的抗氧化能力随着提取温度的升高而逐渐增强，当温度达到60℃时达到最大值，之后随着提取温度的升高而逐渐降低，且在50、60和70℃之间差异显著（p＜0.05）。因此在实验选择的水平范围内，提取温度的适宜范围为50～70℃。

2.1.4提取时间对紫薯花色苷提取效果的影响由图4可知，提取物紫薯花色苷含量随着提取时间的延长而逐渐增加，2.0h达到最大值，之后开始逐渐下降，而紫薯花色苷的含量在1.5、2.0和2.5h之间差异显著（p＜0.05）。可能由于热敏感物质紫薯花色苷在较高温度下长时间浸提，导致其结构受到破坏，含量降低［21-22］。因此在实验选择的水平范围内，紫薯花色苷提取时间适宜范围为1.5～2.5h。

由图4可知，紫薯提取物的抗氧化能力随着提取时间的延长而逐渐增强，2.0h达到最大值，之后开始逐渐下降，而在1.5、2.0、2.5h之间差异显著（p＜0.05）。因此在实验选择的水平范围内，提取时间的适宜范围为1.5～2.5h。

图4　提取时间对紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影响Fig.4　Effect of extraction time on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

2.1.5液料比对紫薯花色苷提取效果的影响由图5可知，提取物紫薯花色苷含量随着液料比的增大而逐渐增加，同时紫薯花色苷的含量在液料比40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）之间差异不显著（p＞0.05）。考虑到产率，以及后期的纯化效率，选择40∶1（mL/g）作为提取紫薯花色苷的液料比。

由图5可知，紫薯提取物的抗氧化能力先随着液料比的增大而逐渐增加，当液料比在40∶1～50∶1时，变化趋势平缓，且抗氧化能力差异不显著（p＞0.05）。考虑到产率，以及后期的纯化效率，选择40∶1（mL/g）作为液料比。

图5　液料比对紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影响Fig.5　Effect of liquid-material ratio on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

2.2紫薯中花色苷类物质提取工艺的模型建立及其显著性检验

在单因素实验的基础上，通过统计软件设计了20组实验（表2）。通过优化柠檬酸质量分数、提取温度以及提取时间3个因素，以紫薯花色苷含量作为响应值Y1，确定20组实验条件后再测定紫薯提取物抗氧化能力（IC50值），并以IC50值作为响应值Y2，紫薯中花色苷的提取工艺中心组合实验设计与结果见表2。

2.2.1紫薯花色苷提取工艺的模型建立及其显著性检验对表2中的数据拟合二次多元回归方程，紫薯提取物中花色苷含量的预测方程为：

Y1=7.19+0.25X1+0.081X2+0.005X3-0.25X1X2-0.074X1X3+0.084X2X3-0.58X12-0.083X22-0.29X32

表2　紫薯中花色苷的提取工艺中心组合实验设计与结果Table 2　Central composite design and results of the extraction of purple sweet potato anthocyanins

表3　回归模型的方差分析Table 3　Analysis of variance of the fitted regression model

由回归模型的方差分析（表3）可以看出，本模型具有非常高的F回归值（75.60）和非常低的p值（p＜0.0001），表明该模型是极显著的；而非常低的F失拟值（1.15），失拟项p=0.4425＞0.05，说明失拟不显著；R2Adj=0.9725，说明该模型能够解释97.25%的响应值变化，仅有总变异的2.75%不能用此模型来解释。R2=0.9855，说明实验值与预测值之间有着良好的相关性。该模型实验误差小，拟合程度良好，所以可用于对紫薯花色苷的提取进行分析和预测。此外，该模型中，X1、X1X2、X12和X32影响极显著（p＜0.01），X2、X2X3、X22影响显著（p＜0.05）。

2.2.2紫薯花色苷抗氧化能力的模型建立及其显著性检验柠檬酸质量分数、提取温度和提取时间3个因素与紫薯花色苷抗氧化能力之间的二次多元回归方程为：

Y2=124.03-3.61X1-1.02X2-0.028X3+3.92X1X2+1.40X1X3-0.18X2X3+9.83X12+2.34X22+3.81X32

从表3中可以看出，该模型的F回归值（108.26）和p值（p＜0.0001）表明该模型极显著；非常小的F失拟值（0.95），失拟项p=0.5238＞0.05，说明失拟不显著；R2Adj=0.9813，说明该模型能够解释98.13%的响应值变化；R2=0.9901，说明实验值与预测值之间有着良好的相关性。所以该模型可用于对紫薯花色苷的抗氧化能力进行分析和预测。此外模型中，X1、X1X2、X12、X22和X32影响极显著，X2、X1X3影响显著。

2.3紫薯中花色苷提取工艺及提取物抗氧化能力的响应曲面分析及优化

2.3.1紫薯中花色苷提取工艺的响应曲面分析及优化图6和表3的数据均表明，柠檬酸质量分数和提取温度，以及提取温度和提取时间之间的相互作用显著，而柠檬酸质量分数和提取时间之间的相互作用不显著。此外，通过统计软件Design-Expert分析响应曲面的等高线图，可以得到紫薯花色苷提取的最优条件为柠檬酸质量分数3.15%、提取温度62.73℃、提取时间2.01h。考虑到操作方便，最佳工艺参数分别设定为柠檬酸质量分数3%、提取温度63℃、提取时间2h。花色苷类物质在酸性环境下比较稳定，而花色苷的结构和稳定性受pH的影响很大，只有在最适的pH，紫薯花色苷才能发挥最强的生理活性［18］。提取植物中的多酚类物质，提取温度是需要考虑的重要因素，温度升高有利于生物活性物质从植物的细胞中释放，而超过了最适温度之后，可能导致对热敏感的物质在提取过程中发生分解或者产生异构化反应［19-20］。提取时间也是影响多酚提取效率的一个重要因素［21-22］，在一定的浸提温度下，当提取时间超过最佳提取时间时，紫薯花色苷的含量反而降低。

图6　各因素交互作用对紫薯花色苷提取影响的响应曲面图Fig.6　Responsesurfaceplotsfortheeffectofextractionparameters on the extraction of anthocyanins from sweet purple potato

2.3.2紫薯提取物抗氧化能力的响应曲面分析及优化图7显示了不同实验因素（柠檬酸质量分数、提取温度以及提取时间）对于紫薯提取物抗氧化能力的影响。图7和表3的数据均表明，柠檬酸质量分数和提取温度以及柠檬酸质量分数和提取时间之间的相互作用是显著的，而提取温度和提取时间之间的相互作用不显著。此外，可以得到优化后的提取条件如下：柠檬酸质量分数3.17%、提取温度60.76℃、提取时间1.99h。考虑到操作方便，最佳工艺参数分别设定为柠檬酸质量分数3%、提取温度61℃、提取时间2h。））

图7　各因素交互作用对紫薯提取物抗氧化能力影响的响应曲面图Fig.7　Responsesurfaceplotsfortheeffectofextractionparameters on the antioxidant activity of sweet purple potato extracts

2.3.3提取参数的优化与模型验证实验通过比较，发现提取物中紫薯花色苷的含量与IC50值之间呈现显著的负相关性（r=-0.9855），因此可以利用同样的预测条件来提取紫薯花色苷，同时取得最强的抗氧化活性。综合提取物中紫薯花色苷含量和抗氧化活性两个实验指标，紫薯花色苷含量为主要测定结果，得到紫薯花色苷的最佳提取条件为柠檬酸质量分数3%、提取温度63℃、提取时间2h，同时以主要指标的优化结果作为最终工艺条件。在此条件下紫薯花色苷的含量为7.21mg/g，同时抗氧化活性（IC50值）为123.93μg/mL。

有研究表明，紫薯显著的抗氧化活性，正是其特有的花色苷等具有生物活性的成分所赋予的［23-24］。为了验证该模型的准确性，在不同的提取条件下进行了10组验证实验（均选择在实验的范围之内，5组实验按照得到的最优条件进行，另外5组随机选择）。在10组验证实验中实验值与预测值（花色苷含量和抗氧化活性）的相关系数都大于0.98，并且差异不显著（p＞0.05），证明该模型能较好地用于紫薯提取物中花色苷含量以及提取物抗氧化能力的预测及评价。

3　结论

以紫薯为原料，利用热水提取的方法对紫薯花色苷进行提取，通过单因素实验和响应曲面法对提取工艺进行优化，得到了紫薯花色苷的最佳提取条件：柠檬酸质量分数3%，提取温度63℃，提取时间2h，液料比为40∶1mL/g，在此条件下紫薯花色苷的含量可达7.21mg/g，同时抗氧化活性（IC50值）为123.93μg/mL，紫薯提取物具有最强的抗氧化活性。该方法准确可靠，可以应用于紫薯中花色苷类物质的提取，为我国紫薯资源的开发利用提供了参考。

［1］Zhang ZF，Fan SH，Zheng YL，et al.Purple sweet potato color attenuates oxidative stress and inflammatory response induced by D-galactose in mouse liver［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47（2）：496-501.

［2］Choi JH，Hwang YP，Park BH，et al.Anthocyanins isolated from the purple-fleshed sweet potato attenuate the proliferation of hepatic stellate cells by blocking the PDGF receptor［J］. EnvironmentalToxicologyandPharmacology，2011，31（1）：212-219.

［3］HaniehH，GerileC，NarabaraK，etal.Invivo immunomodulatory effects of dietary purple sweet potato after immunization in chicken［J］.Animal Science Journal，2010，81（1）：116-121.

［4］温桃勇，刘小强.紫色甘薯营养成分和药用价值研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37（5）：1954-1956，2035.

［5］李彦青，卢森权，黄咏梅，等.紫色甘薯花青素的应用前景［J］.安徽农业科学，2008，36（29）：12641-12642，12646.

［6］Goda Y，Shimizu T，Kato Y，et al.Two acylated anthocyanins from purple sweet potato［J］.Phytochemistry，1997，44（1）：183-186.

［7］Terahara N，Shimizu T，Kato Y，et al.Six diacylated anthocyanins from the storage roots of purple sweet potato，Ipomoea batatas［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1999，63（8）：1420-1424.

［8］Park SJ，Shin WH，Seo JW，et al.Anthocyanins inhibit airway inflammation and hyperresponsiveness in a murine asthma model［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45（8）：1459-1467.

［9］Wang LS，Stoner GD.Anthocyanins and their role in cancer prevention［J］.Cancer Letters，2008，269（2）：281-290.

［10］Hwang YP，Choi JH，Choi JM，et al.Protective mechanisms of anthocyanins from purple sweet potato against tert-butyl hydroperoxide-induced hepatotoxicity［J］.Food andChemical Toxicology，2011，49（9）：2081-2089.

［11］李杨，韩富亮，李记明，等.葡萄皮渣中三种主要花色苷的优化提取［J］.食品工业科技，2012（2）：257-260，264.

［12］Liazid A，Guerrero RF，Cantos E，et al.Microwave assisted extraction of anthocyanins from grape skins［J］.Food Chemistry，2011，124（3）：1238-1243.

［13］Corrales M，Toepfl S，Butz P，et al.Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics high hydrostatic pressure or pulsed electric fields：A Comparison［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9（1）：85-91.

［14］陈小婕，曾画艳，张晓娇，等.紫薯花色苷提取的响应曲面优化及抗氧化作用［J］.食品科技，2013，38（9）：179-184.

［15］刘艳杰，张健.紫薯花色苷提取工艺的优化研究［J］.食品工业，2011（10）：48-51.

［16］刘丽香，Laurat T，梁兴飞，等.Folin-Ciocalteu比色法测定苦丁茶中多酚含量［J］.茶叶科学，2008，28（2）：101-106.

［17］Leong P，Shui G.An investigation of antioxidant capacity fruits in Singapore markets［J］.Food Chemistry，2002，76（1）：69-75.

［18］Kano M，Takayanagi T，Harada K，et al.Antioxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato，Ipomoera batatas cultivar Ayamurasaki［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2005，69（5）：979-988.

［19］González-Montelongo R，Lobo MG，González M.The effect of extraction temperature，time and number of steps on the antioxidant capacity of methanolic banana peel extracts［J］. Separation and Purification Technology，2010，71（3）：347-355.

［20］Pinelo M，Rubilar M，Jerez M，et al.Effect of solvent，temperature，and solvent-to-solid ratio on the total phenolic contentandantiradicalactivityofextractsfromdifferent components of grape pomace［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（6）：2111-2117.

［21］Spigno G，Tramelli L，Faveri DMD.Effects of extraction time，temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics［J］.Journal of Food Engineering，2007，81（1）：200-208.

［22］Thoo YY，Ho SK，Liang JY，et al.Effects of binary solvent extraction system，extraction time and extraction temperature on phenolic antioxidants and antioxidant capacity from mengkudu（Morinda citrifolia）［J］.Food Chemistry，2010，120（1）：290-295.

［23］KähkönenMP，HeinonenM.Antioxidantactivityof anthocyanins and their aglycons［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（3）：628-633.

［24］Shih PH，Yeh CT，Yen GC.Anthocyanins induce the activation of phase II enzymes through the antioxidant response element pathway against oxidative stress-induced apoptosis［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（23）：9427-9435.

Optimizing the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from purple sweet potato by using response surface methodology

YANG Yang，ZHANG Xin*，WU Zu-fang，WENG Pei-fang
（Department of Food Science，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The response surface methodology was used to optimize the hot water extraction of anthocyanins from purple sweet potato.Three parameters including citric acid mass fraction，extraction temperature and extraction time were optimized based on anthocyanins content and the antioxidant activity of the extract.The optimum extraction conditions were citric acid mass fraction 3%，extraction temperature 63℃ and extraction time 2h for anthocyanins.Under this extraction condition，the extraction rate of purple sweet potato anthocyanins was 7.21mg/g，and the IC50value for DPPH radical scavenging activity was 123.93μg/mL.The results suggested that the regression models were accurate and adequate for anthocyanins extraction from purple sweet potato，while the extraction showed the highest antioxidant activity.

response surface methodology；purple sweet potato；anthocyanins；extraction；antioxidant activity

TS201.2

B

1002-0306（2015）10-0278-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.050

2014－08－18

杨阳（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

张鑫（1986-），男，博士，讲师，研究方向：食品生物技术。

宁波大学人才工程项目（zx2013000782）；宁波大学校学科项目（xkl141055）；宁波大学校级科研项目（XYL14026）。