新疆喀什地区传统发酵酸乳中乳酸菌多样性的初步分析

袁雪林，杨　洁，胡　敏，焦　琳

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046）

新疆喀什地区传统发酵酸乳中乳酸菌多样性的初步分析

袁雪林，杨洁*，胡敏，焦琳

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046）

为了对采自喀什地区的22个传统发酵酸乳样品的多样性进行研究，采用免培技术聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）结合传统培养分离方法对22个酸乳样品进行研究。结果表明：用传统方法分离得到7种乳酸菌，其中德氏乳杆菌（L.delbrueckii subsp）为优势菌群。对采用PCR-DGGE方法得到的4条条带进行序列比对，结果表明瑞士乳杆菌（Lactobacillus.helveticus）的丰度最高，是酸乳样品中的优势菌群，次优势菌分别为德氏乳杆菌（Lactobacillus.delbrueckii subsp）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。传统分离法与PCR-DGGE技术结合能够更有效、更全面地分析传统乳制品中微生物的多样性及优势菌。

变性梯度凝胶电泳，乳酸菌，优势菌

新疆是我国重要的牧业基地，自然环境和气候差异很大。各少数民族长久以来习惯制作传统发酵酸奶作为日常饮品，其中主导发酵的乳酸菌群也因地域、气候及制作习惯等原因具有明显的差异性，乳酸菌资源的生物多样性和基因多样性是其他国家和地区所没有的［1］。近些年来，随着酸奶工业的飞速发展，对于菌种资源的保护和利用也得到了越来越多的重视。

发酵食品中微生物多样性的分析方法主要有免培养和培养两种技术。传统培养分离方法工作量大，操作繁琐，且自然环境中存在大量不可培养的微生物，因此传统培养不能完全鉴定出环境中微生物的群落结构［2-3］。Fischer和Lerman等［4］最先提出变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术，并用于DNA突变的检测。Muyzer等［5］首次把DGGE技术用于微生物菌落和生物膜系统的菌落多样性研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异性方面的优越性。董晓婉等［6］利用PCR-DGGE对新疆传统酸乳制品中乳酸菌的群落结构进行分析，并通过传统培养技术和序列分析进行了验证，快速准确的确定了样品中乳酸菌的群落结构及优势菌。DGGE技术既可用于传统发酵制品中微生物群落结构的分析，也可对已分离纯化的菌株分组和筛选，与琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，具有分辨精度高，可快速准确地鉴定自然环境或人工环境中微生物种群，分析复杂微生物群落的结构演替规律等优点［7］。目前该技术已广泛应用于微生物分子生物学的各个研究方向，已成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一［8］。

目前，传统乳制品中乳酸菌的群落结构分析主要通过传统培养技术或现代分子生物学技术，但结合两种方法对新疆传统酸乳制品中乳酸菌的菌落结构进行研究还鲜有报道。本文利用免培PCR-DGGE技术结合可培两种方法对新疆南疆喀什地区22个酸乳样品中乳酸菌的多样性进行了初步研究，分析其乳酸菌群落结构及优势菌，为酸乳制品发酵剂的开发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

22份酸乳采集自新疆喀什周边农牧民家庭；革兰氏阳性菌DNA提取试剂盒TIANGEN BIOTECH BEIJING CO.LTD；buffer、dNTP MIX、rTaq、RNA酶、溶菌酶、蛋白酶K均购买自宝生物中国大连有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Tris-EDTA（TE）、PBS缓冲液、10%SDS、Tris饱和酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，v/v） 均购自上海生物工程有限公司。

变性梯度凝胶电泳仪、PCR基因扩增仪美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统Syngene；高速冷冻离心机（12000r/min） 力康有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品处理及培养基配制22份酸乳样品采集后保存于灭菌采集管内，一式三份（各50mL），冰盒中保存并尽快送回实验室于4℃保存，进行后续实验。喀什市采集的样品标记为：KS-4-b、KS-6-B、KS-3-b、ORD、KS-5-b、KS-1-a、KS-a；阿图什市采集的样品的样品标记为：ATS-4-c、ATS-3、ATS-1-a、ATS-2-a；塔什库尔干县采集的样品标记为：kb、AH-1-b、T-1-a、W-1-3、C-1-a、TH-1-c、D-1-b、S-1-a、Tz-1-b、Kz-a、sb-1-b。

MRS培养基、M17培养基、改良MC培养基配制方法参照相关资料［9］。

1.2.2乳酸菌的分离鉴定利用生理盐水将22个样品稀释为10-3、10-4、10-5浓度的菌悬液。取0.1mL菌悬液于加有2%（m/v）碳酸钙的MRS培养基、改良MC培养基和M17培养基上涂布均匀，37℃恒温培养48h。选取细菌数量适中的平板，挑取有溶钙圈的单菌落在MRS培养基上划线纯化。

利用革兰氏阳性菌DNA提取试剂盒。提取乳酸菌基因组。对基因组进行16SrDNA PCR扩增。扩增体系为10×PCR buffer 2.5μL，d NTP MIX 2μL，引物27f 1μL，引物1492r 1μL，基因组DNA模板2μL，TaKaRa rTaq酶0.5μL，ddH2O补充至25μL。循环参数如下，预变性5min，94℃变性1min，退火1min，72℃延伸2min，35循环，72℃末端延伸10min。1%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，于紫外灯下对条带进行观察和拍照。PCR成功条带送于上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3总DNA提取与PCR扩增将酸奶用PBS缓冲1∶1（v/v）稀释，4℃ 2000r/min离心5min，收集上清液。上清液于7.5mL无菌离心管中4℃下6000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀在-20℃冰箱中冷冻40min。沉淀溶化后，用2mL PBS缓冲液洗涤2次，4℃6000r/min离心10min弃去上清。沉淀重悬于2mLTE缓冲液，加入溶菌酶（终浓度10mg/mL），37℃水浴lh。加入等体积的CTAB抽提液，65℃处理30min分别加入蛋白酶K（终浓度50mg/mL）和10%SDS溶液（终浓度l%），55℃处理2h。在冰上冷却后，加入等体积的Tris饱和酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，v/v），12000r/min离心15min。反复抽提蛋白，上清液转移到另一无菌离心管中。向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃过夜沉淀DNA，10000r/min离心10min收集DNA沉淀。70%乙醇0.5mL洗涤沉淀2次，待自然晾干后，用50μL TE溶液溶解；最后用终浓度为50mg/mL的RNA酶37℃水浴处理60min，即得基因组DNA粗提取液。所得基因组DNA用1%琼脂糖电泳检测。

以总基因组为模板，上游引物为HDA2（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）；下游引物为Lac1GC（5’-CGC CCG GGG CGC CCG GGC CGC GGG GCA CCG GGG CGC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCA GCA GTA GGG AAT CTT CC-3’）。PCR反应体系为50μL：3.0μL MgCl2（25mmol），5.0μL 10×buffer（Mg2+free），4.0μL d NTP mix，3.75μL template DNA，0.75μL 10μmol每种引物，0.5μL Taq polymerase（5U/μL），ddH2O补足50μL。

1.2.4DGGE分析DGGE胶的制备：10%聚丙烯酰胺凝胶浓度，变性梯度为30%～55%［10］。在60℃恒温条件下，75V固定电压下电泳17h。将DGGE胶放入1× TAE液中（含0.5mg/L EB）在脱色摇床上慢速摇15～20min，回收染色液，将DGGE胶置于适量超纯水中，紫外成像系统观察拍照。

对PCR-DGGE泳道中的主要亮带进行割胶回收，按1.2.3的方法扩增。送深圳华大基因科技服务有限公司旗下华大基因测序。运用BLAST程序将测序结果与NCBI核酸数据库中的公开序列进行比较，确定分离细菌的种属。

1.3数据处理与分析

采用Quantity one（BIO-RAD）软件对图像进行分析。

2　结果与分析

2.1传统培养方法的16SrDNA鉴定结果

对1.2.2可培实验中分离得到56株乳酸菌的保守16SrDNA进行PCR扩增，部分扩增结果如图1。图1中泳道1～11在1500pb左右的条带为目的条带，7、8目的条带扩增失败，分析可能为模板DNA质量太差。对扩增成功的条带进行测序。

通过BLAST程序将测序结果与NCBI核酸数据库中的公开序列进行比对得到56株菌中德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.）46株，占所筛选菌种数的82%；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）2株，占所筛菌种数的4%；瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）2株，占所筛菌种数的4%；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus strain）1株，占所筛菌种数的2%；鸡乳杆菌（Lactobacillus gallinarum）2株，占所筛菌种数的4%；屎肠球菌（Enterococcus faecium）1株，占所筛菌种数的2%；耐久肠球菌（Enterococcus durans）2株，占所筛菌种数的4%。

2.2DNA提取与PCR扩增结果

分别从22个酸奶样品中提取总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳成像，部分样品DNA电泳结果见图2。图2中目的条带为15000pb左右，出现少许拖尾现象，但不影响后续实验。

图1　部分16SrDNA区域扩增结果Fig.1　16SrDNA region amplification results

图2　琼脂糖凝胶电泳检测部分基因组DNA结果Fig.2　Agarose gel electrophoresis for detection of genomic DNA results

对22个酸奶样品的总DNA进行扩增，获得片段大小约为200bp的16SrDNA基因的扩增产物，部分样品16SrDNA基因的扩增产物琼脂糖凝胶电泳成像结果见图3。图3中1～8号泳道目的条带清晰，且条带大小相同。

由图3看出，1～8号均有荧光条带，说明PCR成功，满足后续DGGE上样要求。

2.3DGGE电泳图谱分析

对样品总DNA的16SrDNA PCR扩增成功的PCR产物进行变性凝胶梯度电泳，结果见图4。

DGGE是一种相对快速准确的检测细菌群落的指纹技术。根据DGGE的原理，每一个条带大致与群落中的一个优势菌群或操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）相对应［11］。

图3　部分16SrDNA区域扩增结果Fig.3　16SrDNA region amplification results

图4　不同酸奶样品总DNA的16SrDNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳图谱Fig.4　Denaturing gradient gel electrophoresis 16SrDNA PCR products of different yogurt samples of total DNA

如图4所示，在DGGE电泳图谱上显示，每个样品经过PCR-DGGE都分离出1～2条明显的电泳条带，泳道3、5、6、9、10、14、15、16、18、19、20、21、22中含有2种优势菌群（a、b），泳道1、4、17菌群单一（b），泳道7、8、11、12优势菌群有两种（c、d），泳道13优势菌群为一种（c）。DGGE图谱上不同条带代表不同的微生物种类，条带的亮度代表微生物的丰度，条带越亮则微生物的丰度越高［12］。Quantity one（BIO-RAD）软件分析结果显示，条带b丰度最高，为44%，为主要优势菌群。a、c、d为次优势菌群，所占比列分别为33%、13%、10%。

对图4中标记的较明显的条带进行割胶回收、测序，结果与GenBank数据库中已有序列进行比对，结果为：条带a与德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp）相似性为99%，条带b与瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）相似性为98%，条带c与德式乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）相似性为98%，条带d与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）相似性为98%。

3　结论

本研究采用可培结合非可培的PCR-DGGE技术分析研究了新疆南疆地区乳酸中乳酸菌的菌落结构及优势菌群。传统可培技术共分离得到7种乳酸菌，共56株。分别为德氏乳杆菌46株；发酵乳杆菌2株；瑞士乳杆菌2株；嗜酸乳杆菌1株；鸡乳杆菌2株；屎肠球菌1株；耐久肠球菌2株。其中优势菌为德式乳杆菌。PCRDGGE指纹图谱中共有4种明亮条带，通过测序比对得出瑞士乳杆菌为其优势菌，其他三种德式乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳杆菌为次优势菌。结果显示采用PCR-DGGE技术获得的乳酸菌群落结构和优势菌与采用传统培养技术获得的有一定的差异。

可培技术和非可培技术菌显示德式乳杆菌均为优势菌群，PCR-DGGE结果中的其他三种优势菌群在传统分离技术结果中并未表示出来。显示两种方法存在一定的差异性，可能有以下两点原因：自然界的微生物可培养的只占小部分，且传统的培养方法具有很强的选择性，不能从根本上反应样本的微生态系统组成［13-14］。在PCR-DGGE结果中，只对大部分样品中的优势条带进行了分析，但从图中可以看出，不同的泳道差异较大，推测这可能与采样地点和海拔有关，这有待于后续研究。

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Preliminary analysis the diversity of lactic acid bacteria in traditional fermented yogurt Kashi，Xinjiang

YUAN Xue-lin，YANG Jie*，HU Min，JIAO Lin
（College of Life Science and Technology of Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

In order to analyze the diversity of the 22 traditional fermented yoghurt samples that were collected from Kashi.The technology of PCR-DGGE combining traditional culture isolation methods was used to analyze these 22 samples.The results showed that using traditional methods isolated seven kinds of lactic acid bacteria，which Lactobacillus delbrueckii（L.delbrueckii subsp）was the dominant flora.On the use of PCRDGGE bands were obtained in four and had sequence alignment.The results showed that the highest abundance was Lactobacillus.helveticus，which was the dominant bacteria in yogurt samples，sub-dominant bacteria was Lactobacillus.delbrueckii subsp，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Lactobacillus acidophilus.Traditional separation technology combined with PCR-DGGE could be more effective and more comprehensive analysis of the microbial diversity of traditional dairy products and the dominant bacteria.

PCR-DGGE；Lactobacillus；dominant bacteria

TS201.4

A

1002-0306（2015）10-0202-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.033

2014－08－26

袁雪林（1989-），女，硕士研究生，研究方向：生化工程。

杨洁（1963-），女，博士研究生，副教授，研究方向：天然化学产物。