酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能评价研究

马　涛，林　峰，董　哲，张海欣，鲁　军，谷瑞增，蔡木易

（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100027）

酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能评价研究

马涛，林峰，董哲，张海欣，鲁军，谷瑞增，蔡木易*

（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100027）

利用复合蛋白酶水解酪蛋白制备适度及深度水解酪蛋白产品，测定酪蛋白水解物的加工性能。结果表明，经过酶解后，适度水解酪蛋白溶解度接近90%，深度水解酪蛋白溶解度接近100%，显著高于酪蛋白和乳清蛋白。此外，适度水解酪蛋白吸油性、起泡性分别约为乳清蛋白的3倍和1.5倍。深度水解酪蛋白在起泡性和乳化性上也显著高于乳清蛋白。可见，两款酪蛋白水解物在起泡性、乳化性、吸油性、溶解性等方面均在一定程度上优于乳清蛋白，可广泛替代乳清蛋白在食品工业中大规模应用。

酪蛋白，乳清蛋白，加工性能，适度水解酪蛋白，深度水解酪蛋白

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白质，占牛乳中蛋白质总量的80%左右，分子量约75，000～375，000，它主要由αs-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、γ-酪蛋白四种类型蛋白组成。酪蛋白是一种全价蛋白，含有人体必需的8种氨基酸，是优质氨基酸供给源，婴幼儿及幼畜的主要蛋白源［1］。与乳清蛋白相比，酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的蛋白质，加工性能较差，在食品工业中应用容易出现蛋白质沉淀、絮凝或分层等胶体分散不稳定现象，严重影响产品的质量，极大地限制了酪蛋白在食品工业中的应用［2］。

由于乳清蛋白在牛奶中含量较低，价格昂贵，近年来人们开始探索采用酪蛋白水解物部分替代乳清蛋白。酪蛋白经过水解以后，分子量降低，起泡性增加，溶解度升高，加工性能明显改善。同时利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽，具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，极大地提高了酪蛋白产品的附加值，可广泛的应用于烘烤食品、甜点、饮料、乳制品、配方食品中，具有广阔的市场前景和经济效益［3］。

目前国内外针对酪蛋白水解物的研究很多，主要集中在水解工艺条件的确定、酪蛋白磷酸肽含量分析、苦味的去除等方面，而对酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能研究较少。因此，有必要对酪蛋白水解物的功能特性进行研究，为酪蛋白水解物在食品行业中的深入开发和应用提供理论依据和参考［4］。

1　材料与方法

1．1材料与仪器

酪蛋白PRODIET 85B法国Ingredia group公司；乳清蛋白新西兰恒天然集团；蛋白酶NP 50000DSM公司；木瓜蛋白酶南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶、Alcalase、Protemax诺维信公司；盐酸、氢氧化钠等生化试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

RJT03型乳化均质机北京市和莫机电研究所；JB-2型恒温磁力搅拌器上海新泾仪器有限公司；LD4-40型低速大容量离心机北京医用离心机厂；PH030型恒温干燥箱上海实验仪器总厂；GSY-Ⅱ电热恒温水浴锅北京市医疗设备厂；JB-2型恒温磁力搅拌器上海新泾仪器有限公司；pH计HANNA Instruments公司；UDK-159型全自动凯氏定氮仪意大利VELP公司；R-210型旋转蒸发器瑞士Buchi公司；实验室陶瓷膜组件厦门世达膜科技有限公司等。

1.2实验方法

1.2.1酪蛋白酶酶解制备深度水解工艺：500g原料酪蛋白，加入5L纯净水调浆；升温并维持55℃，加入Alcalase 3.2g，木瓜蛋白酶2.5g，开始酶解；反应4h后，85℃水浴15min灭酶；酶解液于3000r/min离心30min，取上清过陶瓷膜，取得澄清过膜酶解液；使用旋转蒸发仪对过膜后酶解液进行浓缩，滤纸抽滤除杂质，喷粉。

适度水解工艺：500g原料酪蛋白，加纯净水调浆至5L，加NaOH 1.0g；升温并维持50℃，加入酶NP50000 1g、胰酶0.32g，开始酶解；反应至1h，加入Protemax 0.5g；反应第2h，85℃水浴15min灭酶，喷粉。

1.2.2酪蛋白水解物功能特性的测定方法

1.2.2.1溶解性称取样品5.0g（准确至0.01g）于50mL烧杯中，用38mL 25～30℃的水分数次将样品溶解于50mL离心管中，加塞。将离心管置于30℃水中保温5min，取出，振摇3min。置于离心机中，以适当的转速离心10min，使不溶物沉淀。倾去上清液，并用棉栓擦净管壁。再加入25～30℃的水38mL，加塞，上下振荡，使沉淀悬浮。再置于离心机中离心10min，倾去上清液，仔细擦净管壁。用少量水将沉淀冲洗入已知质量的称量皿中，先在沸水浴上将皿中水分蒸干，再移入100℃烘箱中干燥至恒重（最后两次质量差不超过2mg）。溶解度按下式计算［5］：

式中：m：样品的质量，g；m1：称量皿质量，g；m2：称量皿和不溶物干燥后质量，g。

三氯乙酸可溶性氮含量（SN-TCA指数）：取0.125g样品溶解到50mL水中的缓冲液中，取10mL于50mL离心管中，加入10mL15%三氯乙酸，振荡均匀后静置20min，然后4000r/min离心20min，取上清液15mL，按微量凯氏定氮法定氮。SN-TCA指数按下式计算：

式中：N1：10mL样品溶液中的总氮含量；N2：10mL样品溶液中溶于20%TCA的氮含量。

1.2.2.2吸油性取4g样品于50mL离心管中，加24mL食用油，每隔5min，搅拌30s，30min后于离心（1600×g）25min，析出未被吸附的油，通过总油与未被吸附油的体积之差，测定其吸附油的能力，按照下式计算吸油性［6］：

式中：V0为总油体积，mL；V为未被吸附油的体积，mL。

1.2.2.3起泡性蛋白质的起泡能力是指蛋白质能降低气-液界面的表面张力而帮助形成气泡的能力。泡沫稳定性是指蛋白质维持泡沫稳定存在的能力［6］。具体测定方法如下：

称取3g样品，配制成100mL蛋白溶液，在高速组织捣碎机中，以1000r/min转速搅拌2min，测定其泡沫体积，按下式计算：

式中：V为搅拌停止时泡沫的总体积，mL。

将上述起泡性测定方法，所测定的泡沫放置，每隔5min测定其泡沫体积，评价其起泡稳定性。

1.2.2.4乳化性称取2.5g样品分散于50mL水中，加50mL食用油，在2000r/min速度下均浆1min，再离心（1300×g）5min［7］，按下式计算乳化能力。

式中：V0为离心管中液体总体积，mL；V为乳化层体积，mL。

按照上述乳化性测定方法配制乳化样品，置于80℃水浴中加热30min，再于自来水中冷却15min，再离心（1300×g）5min，则乳化稳定性如下式计算：

式中：V0′为离心管中液体总体积，mL；V′为乳化层体积，mL。

1.2.2.5持水性准确称取1g蛋白，溶于一定量的蒸馏水中，并定容至100mL，然后量取3mL样液，将其平铺于直径为10cm的培养皿中，置于恒定温度为60℃，相对湿度为60%的环境中，每隔10min测一次样液的水分残存率［7］。样液的水分残存率如下式计算：

式中：m为培养皿所占质量，g；m0为所取样液质量，g；m1为持水一段时间后样液与培养皿所占质量，g。

2　结果与讨论

2.1理化性质分析

表1 蛋白基础理化分析Table 1　Chemical compositions of different proteins

适度水解酪蛋白和深度水解酪蛋白是目前在食品工业获得广泛认可并已经开始进行规模应用的两款酪蛋白水解产品，由于产品制备工艺的不同，两款产品在基础理化成分上也存在一定的差异。从表1中数据可以看出，适度水解后蛋白基础理化指标与原料接近，表明水解过程中并未引入大量杂质，有利于产品在食品工业中的应用。其中深度水解酪蛋白经过离心、膜过滤、浓缩等分离纯化的步骤，蛋白含量上升为81.65%，灰分仅为2.61%，蛋白品质较原料有了一定程度的提升。

2.2溶解性

蛋白质的溶解性与其在食品中的稳定性与风味等直接相关，是蛋白质最重要的加工性能之一。乳品蛋白质的溶解性通常用溶解度表示，受蛋白质的浓度、pH、分子量、离子强度等因素的影响［8］。酪蛋白水解后与原料相比，它们的分子量更小，暴露的离子化氨基和羧基增多，亲水性增强，因此溶解性大幅度提高。如图1所示，酪蛋白原料溶解度仅为62%，经过酶解后适度水解酪蛋白溶解度接近90%，深度水解酪蛋白溶解度接近100%，超过溶解性良好的乳清蛋白。

图1 蛋白溶解度及SN-TCA指数Fig.1　Solubility and SN-TCA index of different proteins

三氯乙酸可溶性氮含量（SN-TCA指数）的定义是：在特定条件下，三氯乙酸（TCA）水溶液中可溶性氮的物质的量分数。三氯乙酸（TCA）是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和肽段。随着水解反应的进行，蛋白质肽链被切成大小不等的片段，三氯乙酸溶解指数提高。可以被三氯乙酸沉淀的肽段所含的最少氨基酸残基数与底物的种类有关，就特定底物而言，三氯乙酸溶解指数可以定性的反应蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽段的含量越高。分子量的大小直接决定着蛋白可被人体吸收利用的效率。酸溶蛋白含量检测可以帮助判定产品中蛋白质及其水解产物的分子量分布状况，可在一定程度上显示产品中肽的纯度。文献报道，酪蛋白经过水解后可产生大量的具有调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效的肽段［9］。适度水解酪蛋白酸溶蛋白含量达51.74%，表明产品大部分高分子蛋白被降解，可溶性活性短肽显著增多。深度水解酪蛋白酸溶蛋白含量达98%，显示其在较宽的pH范围中保持良好的溶解状态，溶液澄清透明，有利于食品加工和营养吸收。相比较而言，酪蛋白和乳清蛋白酸溶蛋白极低，显示其主要为大分子蛋白，消化吸收慢，酸稳定性差。

2.3吸油性

吸油性是指蛋白质产品吸附油的能力，良好的吸油性有利于提高食品中油脂的添加量，从而可改善其组织结构，使其细腻可口，不走油，在贮藏时保持稳定［10］。影响蛋白吸油性的主要因素是蛋白质产品的种类和来源、粒子大小、温度和加工方法。由图2可知酪蛋白吸油性能最差，乳清蛋白要优于酪蛋白。经过水解后，酪蛋白吸油性能明显升高，其中适度水解酪蛋白吸油性约为酪蛋白的3倍，这是因为蛋白质经酶水解，蛋白链的高级结构被打开，疏水性氨基酸残基数增加，亲油性增强，电荷数量增加，阻止了油滴的相互靠近，形成脂质-蛋白质络合物。深度水解酪蛋白吸油性出现一定程度下降，这是因为水解程度越深，分子量越小，亲水性基团逐渐增多导致，但是仍优于酪蛋白和乳清蛋白。

图2　蛋白吸油性测定Fig.2　Oil absorption capacity of different proteins

2.4起泡性

蛋白质是典型的表面活性剂，其起泡性与自身表面张力密切相关，表面张力越小，越易形成泡沫。蛋白质产品的起泡性和泡沫稳定性与蛋白质产品的溶解度存在着一定的关系；温度影响着蛋白质的起泡性和泡沫稳定性，在形成泡沫前，适当的热处理能改进蛋白质产品的起泡性质，但是泡沫稳定性降低。因此，本实验在室温下研究复合蛋白和复合肽的起泡性随时间的变化，从而衡量其泡沫稳定性，结果见图3。

由图3可知，酪蛋白与乳清蛋白起泡性比较相差不大，但是起泡稳定性明显高于乳清蛋白，0～40min时间内酪蛋白泡沫基本保持稳定。适度水解酪蛋白起泡性和稳定性均优于深度水解酪蛋白起泡性。但是适度水解酪蛋白和深度水解酪蛋白起泡性稳定性较差，深度水解酪蛋白起泡稳定时间较短，在0～5min时间内泡沫体积急剧下降；适度水解酪蛋白起泡稳定时间略优于深度水解酪蛋白在0～5min时间内泡沫基本保持稳定，在5～20min内泡沫体积快速下降。

图3　蛋白起泡性随时间变化曲线Fig.3　Foamability-time curve of different proteins

蛋白水解后起泡性提高，因为蛋白质净电荷的提高减弱了疏水相互作用，提高了蛋白质的延长性，使得蛋白质能够更快的扩散到空气-水界面，将空气包埋，提高泡沫的形成能力。但是扩散速度快造成界面膨胀快，泡沫的稳定性降低。同时随着酶解过程的进行，肽段增多，电荷数目也随之增加，当增加到一定程度后，气液薄膜强度降低，泡沫易破裂，起泡性也随之降低［11］。

2.5乳化性

乳化性是指蛋白质产品能将油水结合在一起，形成乳状液的性能。乳化稳定性是指油水乳状液持稳定的能力。从图4中可以看出，酪蛋白及深度水解酪蛋白、适度水解酪蛋白都有一定的乳化能力，其中酪蛋白溶解度最低，乳化性能也较低，仅为38.89%，乳化性与蛋白溶解性存在一定程度的相关性，且深度水解酪蛋白乳化性要高于适度水解酪蛋白。与乳化性不同的是，酪蛋白及适度水解酪蛋白乳化稳定性高于乳清蛋白和深度水解酪蛋白。适度水解酪蛋白乳化稳定性最高达92.66%，深度水解酪蛋白乳化稳定性最低，仅为53.57%。

图4　蛋白乳化性及乳化稳定性测定Fig.4　Emulsion and emulsion stability of different proteins

蛋白质的乳化性力及乳化稳定性受蛋白质含量及结构、水解度、浓度、离子强度、温度等因素影响。蛋白水解的过程中，蛋白的溶解性逐渐提高，蛋白结构发生变化，很多原来包裹在蛋白质分子中的疏水基团暴露出来，亲油性增强，电荷数量增加，阻止了油滴的相互靠近。因此，总体表现为蛋白质分子易分散于油水界面，乳化性增强［12］。同时深度水解酪蛋白乳化性其稳定性明显比酪蛋白的小，其原因可能是由于蛋白分子量相对较小，不利于蛋白质在油界面的扩散和吸附以及具有适宜厚度和流变性质的蛋白膜的形成，因此导致深度水解酪蛋白乳化稳定性较弱。

2.6持水性

蛋白质的持水性就是指蛋白质产品保持水分的能力，蛋白质的持水能力受到蛋白浓度、离子种类、环境因素等的影响，决定持水性的因素是蛋白结构和蛋白质所带净电荷的数量。蛋白持水性直接影响着着食品感观、物料弹性、食品保鲜、机械强度，是决定食品加工性能的重要因素［7］。由图5中可以看出，酪蛋白持水能力最差，乳清蛋白、适度水解酪蛋白、深度水解酪蛋白持水能力相近，蛋白持水趋势和溶解性的趋势是非常类似的。水解后分子量更小，暴露的离子化氨基和羧基增多，亲水性增强，有利于水分的保持。但是深度水解酪蛋白和适度水解酪蛋白持水性变化不大，这也表明蛋白持水性是受到浓度、电荷、蛋白性状等多重因素影响的。

图5　蛋白水分残存率随时间变化曲线Fig.5　Water retention rate of proteins at different time

3　结论

蛋白质在生产、储藏及消费各环节中对食品能产生影响的加工性能主要包括溶解性、持水性、吸油性、起泡性和起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性等，它们影响食品的最终用途。由于天然酪蛋白加工性能差、难消化、乳清蛋白原料昂贵等因素，极大地限制了其在食品行业中的应用。适度水解酪蛋白是对酪蛋白进行适度水解，利用蛋白酶切断肽链，增强蛋白溶解性，使酪蛋白加工性能初步达到或者超过乳清蛋白。由于适度水解酪蛋白在营养价值、口感方面与酪蛋白原料大致相同，加工性能与乳清蛋白相近，可以作为普通功能食品广泛长期使用。深度水解酪蛋白是将酪蛋白深度水解的产物，终产物包含大量防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，调节血压，治疗缺铁性贫血的活性肽段，应用前景广阔［13］。从实验结果看，酪蛋白进行水解后，蛋白溶解性、持水性、乳化性、起泡性等加工性能较原来均有了明显地改善，深度水解酪蛋白除在乳化稳定性方面低于乳清蛋白外，在起泡性、溶解性、吸油性、持水性等方面均接近或优于乳清蛋白，适度水解酪蛋白虽然在溶解性、乳化性方面低于乳清蛋白，但在起泡性、吸油性、乳化稳定性等方面均优于乳清蛋白。因此采用酪蛋白水解物部分替代乳清蛋白，是乳品原料行业未来发展的重要方向，具有广阔的应用前景和经济效益。

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Study on processing performance evaluation of casein hydrolysate substituting for whey protein

MA Tao，LIN Feng，DONG Zhe，ZHANG Hai-xin，LU Jun，GU Rui-zeng，CAI Mu-yi*
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100027，China）

Partically hydrolyzed casein and extensively hydrolyzed casein were prepared by compound enzymatic hydrolysis，and the processing performance of casein hydrolysates was measured.The results showed that after enzymatic hydrolysis the Solubility of partically hydrolyzed casein and extensively hydrolyzed casein reached almost to 90%and 100%respectly，significantly higher than that of casein and whey protein.In addition，the oil absorption capacity and foamability of partically hydrolyzed casein were about 3 times and 1.5 times respectively compared to whey protein.The foamability and emulsibility of extensively hydrolyzed casein were also significantly above whey protein.Both casein hydrolysates were better than whey protein on the foamability and emulsibility，oil absorption，solubility，etc，to some extent and casein hydrolysates would be widely applied in the food industry substituting for whey protein.

casein；whey protein；processing performance；partically hydrolyzed casein；extensively hydrolysed casein

TS252

A

1002-0306（2015）10-0096-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.011

2014-03-26

马涛（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食物过敏。

蔡木易（1962-），男，大学本科，教授，主要从事蛋白质资源利用、功能肽研发与产业化方面的研究。

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102205-02）；国家十二五科技支撑项目（2012BAD33B04-02）；科技部院所基金（2011EG111236）。