青稞HbSnRK2.4的克隆及其序列特征与表达特性分析

曾兴权王玉林徐齐君原红军韦泽秀尼玛扎西

（1. 西藏自治区农牧科学院，拉萨 850002；2. 西藏自治区青稞种质改良和牦牛繁育重点实验室，拉萨 850002；3.西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所，拉萨 850002）

青稞HbSnRK2.4的克隆及其序列特征与表达特性分析

曾兴权1，2王玉林1，2徐齐君1，2原红军1，2韦泽秀2，3尼玛扎西1，2

（1. 西藏自治区农牧科学院，拉萨 850002；2. 西藏自治区青稞种质改良和牦牛繁育重点实验室，拉萨 850002；3.西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所，拉萨 850002）

干旱胁迫是制约农作物生产的重要限制因素之一，研究并增强作物的抗旱性具有重要意义。SnRK2（Sucrose nonfermenting 1-related protein kinase 2）基因编码一类蔗糖非酵解型蛋白激酶，该酶在ABA信号转录途径和抗渗透胁迫中起着重要作用。以青稞（Hordeum vulgare subsp. vulgare）抗旱品种喜马拉雅10号为材料，利用RT-PCR技术克隆获得了SnRK2基因全长cDNA序列，命名为HbSnRK2.4（登录号：KJ699389）。生物信息学分析表明，该基因全长1 310 bp，编码362个氨基酸序列，蛋白分子量为41.94 kD，等电点（pI）为5.96。Prosite Scan分析结果表明，HbSnRK2.4含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点，如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点等。利用实时定量PCR方法研究了HbSnRK2.4在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况，发现HbSnRK2.4在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高，随着土壤绝对含水量的下降而下调表达；当达到作物正常生长所需的土壤绝对含水量时又开始上调表达；进行干旱胁迫后（＜15.5%）基因表达量下降；复水后8 h时恢复正常表达水平。

青稞；HbSnRK2.4；基因克隆；干旱胁迫；表达模式

干旱是我国较为严重的自然灾害之一，它是影响农作物生长、限制农作物产量的非生物胁迫因子之一，能够引起植物体内一系列生理代谢反应和生长的可逆性抑制，严重时引起植株不可逆的伤害甚至死亡［1］。每年在西藏雨季到来之前，青稞正处于拔节期，经常会受到干旱胁迫的影响。因此，为了提高青稞的产量和品质，选育抗旱青稞新品种，加强对抗旱相关基因的研究有着极其重要的现实意义。

作物的抗（耐）旱性是一个非常复杂的由多基因控制的性状，涉及从信号转导基因到转录调控基因，以及保护、防御、胁迫耐受基因的表达［2］。研究表明，干旱会显著诱导植物ABA水平上升，这一激素信号将引导植物产生一系列的逆境响应［3］，如叶表气孔的关闭和开度减小，最终在一定程度上增强植物对水分胁迫的耐受能力。在干旱胁迫中，由蛋白激酶介导的蛋白质的可逆磷酸化作为高等植物受渗透逆境诱导的主要信号转导途径之一，广泛参与了植物对干旱、盐胁迫、ABA、光等的应答反应。蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，SnRK）是一类广泛存在于植物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了植物体内多种信号途径的转导。根据序列相似性、结构域特征和细胞的功能，植物中的SnRK基因可分为3个 亚 组：SnRK1、SnRK2和SnRK3［4］，SnRK2和SnRK3是植物特有的蛋白激酶，参与植物对逆境胁迫的反应［5］。其中，SnRK2（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2）是一个相对较小的基因家族，在拟南芥中已发现10个SnRK2家族成员，5个参与ABA应答反应［6，7］，AtSnRK2.8/AtSnRK2C的过表达可以增强拟南芥的抗旱能力［8］；在水稻中也有10个SnRK2成员，依次命名为SAPK1-SAPK10，其中SAPK8、SAPK9和SAPK10可以被ABA激活［9］；在玉米中有11个SnRK2成员，5个受ABA激活［10］；在苹果中有16个SnRK2成员，预测12个能够响应ABA诱导［11］；此外，在小麦中发现PKABA1、TaSnRK2.4、TaSnRK2.8和TaSnRK2.9 等4种SnRK2基因与ABA信号传导有关［12-14］，在燕麦中EeSnRK2.6可能参与逆境胁迫反应，增强植物的抗逆性［15］。

鉴于SnRK2蛋白激酶在植物抗逆反应中发挥的重要作用，近年来已有报道在多种植物中克隆到SnRK2家族的相关基因，但迄今未见西藏春青稞中ABA信号转导途径中关键基因SnRK2克隆及功能分析报道。本研究利用 RT-PCR 技术获得了SnRK2基因的全长CDS序列，对其序列进行初步的生物信息学分析，通过Real Time PCR研究HbSnRK2.4在干旱胁迫下的表达模式。

1 材料与方法

1.1 材料

抗旱青稞种质‘喜马拉雅10号’由西藏自治区农牧科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞的干旱胁迫处理 抗旱青稞种质喜马拉雅10号由西藏自治区农牧科学院提供。待幼苗长至4叶期时开始进行自然干旱处理，采用称重法计算土壤绝对持水量，每隔2 d称量1次：从水分过剩土壤绝对持水量33.4%（C1），27.5%（C2），21.1%（C3）至青稞正常生长适宜土壤绝对持水量15.5%（C4），干旱胁迫9.8%（C5）和4.8%（C6），在各胁迫阶段剪取植株叶片，于液氮中速冻，-70℃保存备用。同时，保留部分重度干旱胁迫（持水量4.8%）植株进行复水处理（恢复持水量至33.4%），分别于复水后2 h（C7）、4 h（C8）、8 h（C9）分别取样，-70℃保存备用。

1.2.2 HbSnRK2.4基因的克隆与Real Time PCR 分析

根据不同时期干旱复水诱导转录组测序分析结果为基础，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异引物S1，以不同时间点样品的总RNA等量混合，经反转录得到的第一链cDNA为模板，得到上游片段。RT-PCR反应在S-1000 Thermal Cycler进行，反应体系采用20 μL PCR扩增体积：Taq DNA聚合酶（TaKaRa，5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR反应缓冲液（TaKaRa） 2 μL，dNTP（10 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL，灭菌水12.6 μL。PCR反应条件：94℃变性4 min；94℃变性50 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，34个循环；72℃延伸10 min。回收目标片段，克隆、测序。

Real Time PCR分析步骤按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行操作，定量PCR引物根据HbSnRK2.4的cDNA序列设计见表1，β-Tublin作为内参基因见表1。实时荧光PCR所获得的数据处理采用双标准曲线法引入斜率，根据张驰宇等［16］的公式进行计算。

表1 本研究中用到的引物

1.2.3 HbSnRK2.4基因的生物信息学分析 利用NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）、ExPAsy（http：//www. expasy.org/tools/pi_tool.html）、TMHMM（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、TargeP（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP）和PSORT（http：//psort. ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）等网络资源对HbSnRK2.4进行序列分析。根据推测的HbSnRK2.4氨基酸序列，利用MEGA5.1软件进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。

2 结果

2.1 HbSnRK2.4基因的克隆和生物信息学分析

以电子克隆延伸得到的序列结合大麦编码SnRK2.4基因的cDNA序列为基础设计特异引物，扩增春青稞苗期叶片的cDNA，获得一个条带1 310 bp的片段。经NCBI网站的ORF finder程序分析，5'-UTR和3'-UTR分别长21 bp和200 bp；基因ORF长1 089 bp，编码一个362个氨基酸的多肽（图1）。推测蛋白的预测分子量为41.94 kD，等电点（pI）为5.96。Prosite Scan分析结果表明，该蛋白含有Protein kinase domain profile 家族特征基序（图1中下划线部分）、蛋白激酶ATP结合区标记（图1中双划线部分）、1个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记（图1中方框部分）、4个酪氨酸激酶磷酸化位点（40-46、94-102、140-146、334-341）、6个 蛋白激酶C磷酸化位点（54-56、172-174、246-248、250-252、307-309、358-360）、7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（96-99、172-175、222-225、250-253、285-288、290-293、319-322）、1个N-豆蔻酰化位点（110-115）、一个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点（247-250）。TMHMM预测该蛋白不含跨膜转移功能区。Signal IP3.0 预测该蛋白没有信号肽，不属于分泌蛋白。PSORT亚细胞定位预测该基因所编码蛋白位于细胞质。

Blastn分析发现，该序列与小麦、二穗短柄草、水稻、玉米、小米、高粱、山羊草、马铃薯和蓖麻等植物的SnRK2基因全长cDNA序列相似度分别为97%、94%、91%、89%、89%、85%、82%、81%和81%。推导的氨基酸序列同源比对分析结果（图2）表明，该基因与小麦、二穗短柄草、水稻、玉米、小米、高粱、番茄、马铃薯和黄瓜等植物相似度分别为97%、94%、91%、89%、89%、85%、81%、81%和80%。基于氨基酸序列的系统进化树表明，该基因与小麦、二穗短柄草和水稻中编码蛋白激酶家族基因具有较近的亲缘关系，而与高粱、番茄和马铃薯已克隆的蛋白激酶家族序列相似度相对较低，因此推断得到了青稞丝/苏氨酸蛋白激酶基因家族一个新成员的全长cDNA序列，将其命名为HbSnRK2.4（KJ699389）。

2.2 HbSnRK2.4基因表达模式分析

利用干旱胁迫和复水条件下9个处理时期的青稞苗期叶片，进一步对HbSnRK2.4基因的表达模式进行分析，结果（图3）表明，HbSnRK2.4基因在土壤绝对含水量达到33.4%（C1）明显上调表达，随着土壤绝对含水量的下降而急剧下降，当达到一定程度后维持一定水平（C2、C3）；当土壤绝对含水量达到作物正常生长所需的土壤绝对含水量时又上调表达（C4）；干旱胁迫后，HbSnRK2.4的表达量随着土壤绝对含水量的下降而又急剧下降，但随着胁迫的加剧未出现明显变化（C5、C6）；复水2 h后表达量有所增加（C7），随着复水时间延长表达量逐渐恢复至正常水平 。这表明HbSnRK2.4基因可能参与调控水涝和干旱胁迫相关的过程。

图1 HbSnRK2.4基因cDNA及其编码氨基酸的全长序列

图2 HbSnRK2.4与其它植物类SnRK基因构建的最小进化树

3 讨论

ABA作为植物体内重要的生长激素，不仅可以调节植物的生长发育，而且在对逆境胁迫的响应中也有着重要的作用［17］。SnRK2是一个相对较小、植物特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶，是受渗透胁迫激活的一类蛋白激酶，参与植物体内多种信号途径的转导；SnRK2基因是ABA信号转导途径中的关键调控酶［18］，它受各种逆境胁迫诱导表达，在提高植物的抗逆性中发挥着至关重要的作用［19］。谭秦亮［20］克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1，发现该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程，在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。徐蓓等［15］从抗旱耐盐性极强的长穗偃麦草中克隆了EeSnRK2.6基因的cDNA序列，该基因可能在参与逆境胁迫反应、增强植物的抗逆性中起着重要作用。在拟南芥中，SnRK2系列基因参与干旱和ABA的诱导过程，其中SnRK2.2、SnRK2.3、SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8可以同时被ABA激活，过表达SnRK2.8的拟南芥抗旱性明显增强［20，21］。小麦TaSnRK2.8参与干旱、高盐、低温及ABA等信号转导的过程，其过量表达可引起转基因植株根部组织含水量、细胞膜稳定性、渗透势等抗逆境生理的一系列变化［22］。陈娜娜等［11］对苹果、拟南芥、水稻、玉米和烟草的SnRK2蛋白激酶进行了系统进化树分析，认为SnRK2可以分成3个亚族。第一亚族包含18个成员，能够响应渗透胁迫但不受ABA诱导；第二亚族包含15个成员，能够响应渗透胁迫和NaCl诱导但ABA诱导的反应较微弱，过表达后能够显著提高植物的抗旱性；第三亚族包含14个成员，能够强烈响应ABA诱导，在保卫细胞中高表达，调节气孔的孔径。此外，研究表明大豆中的SnRK2可以被高渗透逆境诱导激活［23］。

图3 不同水分环境HbSnRK2.4基因表达模式Real Time PCR分析

针对SnRK2底物的研究表明，SnRK2可以使组蛋白（histone）、酪蛋白（casein）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein）及转录因子磷酸化，同时SnRK2也可以使自身磷酸化［24，25］。在水稻和拟南芥中证实了ABA应答转录因子（ABA responsive transcription factors，ABF/AREB）可以作为SnRK2的底物被磷酸化［26］。Shin［27］等研究发现，腺苷激酶（adenosine）、醛酮变位酶（Glyoxalase I）、核糖-5-磷酸异构酶（Ribose 5-phosphate isomerase）、60S核酸核糖体蛋白（60S acidic ribosomal protein P2）均可以作为底物被SnRK磷酸化，这一结果表明SnRK2除了通过活化转录因子调控基因的表达外，还可以直接激活新陈代谢相关的蛋白，从而使植物抵抗逆境。Shukla等［28］认为，根据SnRK2活性的差异，信号途径可以分成两个过程：首先，高渗透胁迫可以引发内源ABA的释放，激活SnRK2，活化的SnRK2可以进一步使bZIP/ABRE/AREB转录因子家族磷酸化，从而引发一系列的转录和翻译水平的活动；另一信号过程是不依赖于内源ABA的快速应答过程，SnRK2通过直接作用于相关基因，从而引发渗透胁迫下的应答过程。

本研究利用同源克隆的方法成功从西藏青稞抗旱种质中克隆到了HbSnRK2.4基因，该基因的表达量受干旱和复水的诱导，可能参与调控水涝和干旱胁迫相关的过程。然而对HbSnRK2.4具体的作用机制尚且不清楚，其是否依赖于内源ABA的响应发挥作用，还是直接作用于相关基因；HbSnRK2.4除了受干旱和复水条件的诱导外，其它逆境条件（如高盐、高温、高辐射、低温等）是否也能诱导它的表达，因此，需要在此基础上进一步加强研究。

4 结论

青稞HbSnPK2.4基因在进化上与小麦和二穗短柄草的SnRK基因具有比较近的亲缘关系，与番茄和马铃薯等具有较远的亲缘关系；HbSnPK2.4基因的表达量同时受到干旱和水涝的诱导，很可能参与了青稞的抗旱过程。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Characterization of HbSnRK2.4 in Tibetan Hulless Barley（Hordeum vulgare L. var. nudum HK.f.）

Zeng Xingquan1，2Wang Yulin1，2Xu Qijun1，2Yuan Hongjun1，2Wei Zexiu2，3Ni Mazhaxi1，2
（1. Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002；2. Barley Improvement and Yak Breeding Key Laboratory of Tibet Autonomous Region，Lhasa 850002；3. Research Insititute of Agriculture Resource and Environment，Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850002）

Drought stress has become one of the important factors that hamper the production of agriculture. Varieties with enhanced drought resistance can be an effective way to solve this problem. SnRK2 gene encoded a kind of Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，which have been thought to play an important role in the ABA signaling pathways and resistance to osmotic stress. However，the exact mechanism underlining is still to be elusive. We presented the isolation of a new SnRK2 gene from Hordeum vulgare subsp. vulgare，nominated as HbSnRK2.4（Accession No. Kj699389） by RT-PCR. The plants were proved to be highly drought tolerance. The gene was 1 310 base pair in length，encoding a peptide of 362 amino acids，about 41.94 kD in molecular weight and with pI=5.96. Results from Prosite Scan indicated that HbSnRK2.4 contains multiple loci of drought stress response cis-element such as casein Kinase II phosphorylation sites，tyrosine kinase phosphorylation sites，protein kinase c-phosphorylation and n-cardamom acylation locus. Expression patterns of HbSnRK2.4 were also investigated by RT-qPCR at serious waterlogging or drought and various time points after recovery. The highest expression level was observed in plants growing in soil absolute moisture 33.4%，which may brought waterlogging to tibet barley. As soil absolute moisture declined，transcriptsdecreased sharply. But when the soil water content turned to be normal for Hordeum vulgare（15.5%），HbSnRK2.4 restored to a higher level. When plants were drought stressed（＜15.5% of absolute moisture），the gene were repressed again. After recovery from draught stress，the plants possessed a normal expression level of HbSnRK2.4.

Tibetan hulless barley；HbSnRK2.4；drought stress；gene cloning；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.017

2014-07-21

“973”计划前期研究专项（2012CB723006），国家科技支撑计划（2012BAD03B01，2013BAD30B01），西藏财政专项（2014CZZ001）

曾兴权，男，博士，副研究员，研究方向：青稞遗传育种；E-mail：xingquanz_2@126.com

尼玛扎西，男，博士，研究员，研究方向：青稞遗传育种；E-mail：nima_zhaxi@sina.com