天津汉族群体DYS19、DYS390和DYS393 STR基因座遗传多态性的研究

琚 端，史云芳，李晓洲，李 岩，辛 力，姚静怡，谢晓媛，刘殿芹，杨晓惠，周佳妍，张 颖

（1.天津医科大学总医院妇产科，天津300052；2.天津市妇女儿童保健中心，天津300074；3.天津医科大学影像学院，天津300203）

我国是出生缺陷高发国家，出生缺陷逐渐成为影响儿童健康和出生人口素质的重大公共卫生问题。染色体非整倍体异常是导致出生缺陷最常见的原因。尽管染色体核型分析是诊断染色体病的金标准，但因其培养时间长、技术要求高，不能满足日益增长的产前诊断需要。短串联重复序列（short tandem repeat,STR）又称微卫星DNA，是一种广泛存在于人类基因组中，以2～6个碱基为单位，具有长度多态性的DNA序列。Y-STR在减数分裂过程中不发生重组，具有稳定的单倍体父系遗传特征，被广泛用于个体识别、亲权鉴定、群体遗传学研究等领域。近年来，定量荧光PCR（QF-PCR）扩增STR基因座已在许多欧洲国家被应用于产前诊断染色体非整倍体的检测[1-2]。STR基因座具有显著的人种和地域分布差异，因此国际遗传学DNA委员会倡导建立各地区各种族的群体遗传学数据[3-4]。笔者对天津汉族男性群体Y染色体上DYS19、DYS390和DYS393 3个STR基因座的遗传多态性进行了研究，为天津地区性染色体异常的基因诊断和产前诊断提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集200例籍贯为天津、三代居住在天津且无亲缘关系的汉族男性个体外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，-20℃保存。所有样本经染色体核型分析结果正常。

1.2 DNA的提取 采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），实验步骤严格按照说明书进行。

1.3 引物选择 根据NCBIUniSTS数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists），确定基因座的引物序列，正向引物5’端均由荧光染料5-羧基荧光素标记，引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基本特征及引物序列见表1。

1.4 QF-PCR扩增 以提取的基因组DNA为模板，在GeneAmp PCR system 9600扩增仪上进行PCR 反应。PCR 扩增体系：d NTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL、模板 DNA 2μL、上游引物 0.5μL、下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O18 μL，总体积为25μL。扩增条件为预变性95℃5 min、变性 95℃30 s、退火 52℃30 s、延伸 72℃30 s，35个循环，最后72℃10min，4℃保存。

1.5 PCR扩增产物检测 产物经毛细管电泳检测，ABIPrism GeneMapper v3.0软件分析数据，得出片段大小，整理结果。

1.6 测序及命名 3个基因座分别选择两个片段进行测序，根据重复序列的重复次数进行命名。测序由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成。

1.7 统计学方法 用直接计算法计算各等位基因频率，基因多样性（GD）采用公式 GD=n（1－ΣPi2）/（n－1）计算，其中Pi为等位基因频率，n为样本数。单倍型多样性（HD）用公式HD＝n（1－ΣHPi2）/（n－1）计算。

2 结果

2.1 DYS19、DYS390和DYS393基因座测序结果DYS19基因座测序185 bp、201 bp两个片段，重复序列为TAGA，分别重复7、11次，将其命名为7、11。DYS390基因座测序208 bp、224 bp两个片段，重复序列为TCTA，分别重复9、13次，将其分别命名为9、13。DYS393 基因座测序 117 bp、121 bp 两个片段，重复序列为TATC，分别重复12、13次，将其分别命名为12、13。

2.2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因频率及单倍型频率 200例汉族男性样本均扩增成功，其中DYS19基因座共发现5个等位基因。等位基因频率在0.070 0～0.377 5之间。DYS390基因座共发现6个等位基因。等位基因频率在0.005 0～0.390 0之间。DYS393基因座共发现6个等位基因。等位基因频率在0.005 0～0.540 0之间。3个基因座的GD值分别为0.743、0.731及0.634。在本文调查的200例天津男性中，3个基因座共发现63种单倍型，其中最多见的单倍型为 8-11-12（0.075），在 15 个个体中出现，单倍型多样性为 0.706 8。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基因频率见表2。

表2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因频率Tab2 Gene frequenciesof DYS19、DYS390 and DYS393

3 讨论

《中国出生缺陷防治报告（2012）》指出，我国出生缺陷发生率为5.6%左右，每年新增出生缺陷儿约为90万例。染色体非整倍体异常是导致出生缺陷最常见的原因。常见的异常包括21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、克氏综合征（47，XXY）、Turner综合征 （45，X）、Jacobs综合征（47，XXX）以及超雄综合征（47，XYY），约占产前诊断临床有意义染色体异常的80%[5]。目前诊断及产前诊断染色体病的金标准是染色体核型分析，但该方法对技术要求高、分析培养时间长，有培养失败的可能，一旦培养失败不但会造成孕妇及家属较重的精神负担并且会延误最佳处理时机。

QF-PCR技术是一种利用荧光引物对染色体上特异性STR位点进行扩增，通过荧光检测染色体拷贝数异常并做出快速产前诊断的方法。因具有准确、简便、快速、自动化、高通量等优点，一些欧洲产前诊断中心已常规将13、18、21、X以及Y染色体的STR基因座用于染色体非整倍体的诊断和产前诊断[1-2]。Plaseski等[6]利用多重QF-PCR方法通过扩增X-STR基因座、SRY基因、Y-STR基因座DYS448和AZF相关基因等联合检测男性不育的遗传性原因，包括染色体异常和Y染色体微小缺失等。

STR最早于真核生物基因组中被发现[7]，因其核心序列的重复次数存在个体差异，故多数STR基因座具有高度多态性。1976年Cooke[8]首先报道了存在于Y染色体上的STR，之后越来越多的Y染色体STR基因座被开发并利用。与常染色体STR基因座分型相比，Y染色体上的基因座无需进行Hardy-Weinberg平衡检验，只需要单倍型分析即可，应用方便。联合多个STR复合扩增可极大程度降低偶合概率，提高个体识别率。男性群体STR基因座的研究表明，Y-STR基因座多态性的分布具有明显的种族、地域差异性。在不同人群甚至关系相近的人群中，其基因频率分布均不同[9-10]。因此，建立当地的等位基因频率和基因型分布资料是利用YSTR进行快速产前诊断的前提和数据基础。

目前，人类基因组数据库中可供人类遗传学研究的Y染色体遗传标记有200多个，其中DYS19、DYS385a/b、DYS389…、DYS389…、DYS390、DYS391、DYS392和DYS393是欧洲Y染色体分型学会建立的“最小单体型”中最常用的一组多态性位点[11]。本研究根据文献报道及预实验选择了常用的易于扩增、结果稳定、重复性好、多态性较高的3个基因座DYS19、DYS390和DYS393进行研究。结果显示DYS19、DYS390和DYS393 3个基因座分别发现5、6、6个等位基因，基因频率分别在0.070 0～0.377 5、0.005 0～0.390 0、0.005 0～0.540 0 之间，3个基因座的基因多样性分别为0.743、0.731、0.634。200例样本中共检出63种单倍型，单倍型多样性为0.706 8。一般来说，STR多态信息量大于0.5，表明遗传标记可提供高度的遗传信息[12]。结果显示，这3个基因座构成的单倍型多态性信息含量较高，具有较高的个体识别率，可提供高度的遗传信息。目前试剂盒中基因座的选择主要基于欧洲、非洲等人群中各个Y-STR的基因座个体识别能力的考虑[13]。然而研究表明不同群体、不同地域关于Y-STR基因座的遗传学数据相比有一定的差异[14]。张玉红等[15]对342例南通汉族无血缘关系男性个体的16个Y染色体STR基因座进行研究，DYS19、DYS390和DYS393 3个基因座分别发现6、6、6个等位基因，GD分别为0.904 2、0.642 6、0.635 7。宋兴勃等[16]研究 111 名成都地区汉族群体17个Y-STR基因座多态性分布，3个基因座分别发现6、6、5个等位基因，GD分别为0.669 3、0.651 4、0.650 3。Brown[17]在研究中提到所有利用QF-PCR进行染色体非整倍体产前诊断的实验室都该建立自己独立有效的数据基础。本研究通过对来本院进行优生咨询的无亲缘关系汉族男性3个Y-STR遗传多态性的研究，建立了本地区、本实验室的人群数据基础和适合本地区人群的反应体系，为性染色体数目异常的基因诊断及产前基因诊断提供了实验数据。

[1]Cirigliano V,Voglino G,Ordo觡ez E,etal.Rapid prenatal diagnosis of common chromosomeaneuploidiesby QF-PCR,resultsof 9 years of clinicalexperience[J].PrenatDiagn,2009,29(1):40

[2]Hills A,Donaghue C,Waters J,etal.QF-PCR asa stand-alone test for prenatal samples:the first2 years′experience in the London region[J].PrenatDiagn,2010,30(6):509

[3]Nasiri H,Noori-DalooiM R,Dastan J,etal.Investigation of QFPCR application for rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies in iranian population[J].Iran JPediatr,2011,21(1):15

[4]Jain S,Panigrahi I,Sheth J,etal.STRmarkers for detecting heterogeneity in Indian population[J].MolBiolRep,2012,39(1):461

[5]Jain S,Panigrahi I,Sheth J,etal.STRmarkers for detecting heterogeneity in Indian population[J].MolBiolRep,2012,39(1):461

[6]PlaseskiT，NoveskiP，Trivodalieva S.Quantitative fluorescent-PCR detection of sex chromosome aneuploidiesand AZF deletions/duplications[J].GenetTest,2008,12(4):595

[7]Miesfeld R,KrystalM,Arnheim N.Amember of a new repeated sequence familywhich is conserved throughouteucaryotic evolution is found between the human delta and beta globin genes[J].Nucleic AcidsRes,1981,9(22):5931

[8]Cooke H.Repeated sequence s specific to humanmales[J].Nature,1976,262(5565):182

[9]White PS,Tatum O L,Deaven L L,etal.New,male-specificmicrosatellitemarkers from the human Y chromosome[J].Genomics,1999,57(3):433

[10]Xu AQ,Xia M,Liu JT.Validation of quantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosisof common aneuploidies in the Chinese population[J].GenetMolRes,2013,12(4):6379

[11]Roewer L,Krawczak M,WilluweitS,etal.Online reference database ofEuropean Y-chromosomalshort tandem repeat(STR)haplotypes[J].Forensic Sci Int,2001,118(2/3):106

[12]ArmstrongRN,Colyer H A,Mills K I.Screening formiRNA expression changesusingquantitative PCR(Q-PCR)[J].MethodsMolBiol,2012,863(3):293

[13]Kayser M,Kittler R,Erler A,etal.A comprehensive survey of human Y-chromosomalmicrosatellites[J].Am JHum Genet,2004,74(6):1183

[14]葛建业，严江伟，谢群，等.中国Y-STR数据库建设相关问题探讨[J].法医学杂志,2013,29(3):212

[15]张玉红，贾东涛，韩海军，等.南通汉族群体16个Y-STR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志,2008,23(3):197

[16]宋兴勃，范红，应斌武，等.成都地区汉族人群17个Y短串联重复序列基因座遗传多态性分析[J].南方医科大学学报,2009,29(10):1973

[17]Brown L,AbiganiaM.Warburton D.Validation ofQF-PCR for prenatal aneuploidy screening in the United States[J].Prenat Diagn,2006,26(11):1068