RACK1与冠心病的关系

王正忠　张俊义　戴红艳　邢明清　管 军*

（青岛市市立医院心内科，山东 青岛 266011）

RACK1与冠心病的关系

王正忠张俊义戴红艳邢明清管 军*

（青岛市市立医院心内科，山东 青岛 266011）

目的 观察冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血中活化的蛋白激酶C受体1（RACK1）的表达，以及探讨RACK1与冠心病的关系。方法选取住院行冠状动脉造影后确诊为冠心病的患者40例，以及40例健康者作为对照组，实时荧光定量PCR法测定患者外周血中单个核细胞RACK1 mRNA表达，应用免疫印迹法测定外周血中单个核细RACK1蛋白表达。结果冠心病（CHD）组患者外周血单个核细胞RACK1 mRNA表达明显高于对照组［（12.56±2.07）比（3.13±0.96），P＜0.01）］，CHD组患者外周血单个核细胞RACK1的蛋白表达明显高于对照组［（3.45±0.87）比（0.76±0.13），P＜0.01］。结论冠心病患者外周血中RACK1在基因和蛋白水平均明显升高，提示RACK1在粥样硬化的发病过程中发挥了重要作用。

冠状动脉粥样硬化；活化的蛋白激酶C受体1

冠状动脉粥样硬化性心脏病是严重威胁人类健康的疾病之一，近年来发病率有明显上升趋势，其重要的病理基础是粥样硬化的形成，目前针对粥样硬化形成的学说众多，而从分子生物学的角度以上述学说为依据，寻找粥样硬化形成过程中相关蛋白以及大分子物质的活性改变与相互作用，从而为药物治疗寻找关键靶点，一直都是研究的重点。活化的蛋白激酶C受体1（receptor for activated C kinase 1，RACK1），属于Trp-Asp40（WD40）家族，具有7个高度保守的WD40结构域，相对分子质量为36 KDa［1-2］。RACK1最早被发现能与PKC结合，因此得名。RACK1作为一种支架蛋白，可以为其他蛋白的相互作用提供一个操作界面，也可以调节其他蛋白的活性，因此它是细胞内信号通路活化以及行使功能的重要蛋白。RACK1在体内广泛表达，主要参与调控胚胎的发育，细胞的生长、分化、迁移，细胞的凋亡，细胞的昼夜节律等［3］。已有研究表明PKC的升高在动脉粥样硬化过程中发挥重要的作用［4］，而RACK1是PKC的锚定蛋白，因此RACK1是否在动脉粥样斑块形成过程中发挥重要作用需要进一步研究。

1　资料与方法

1.1研究对象：入选2014年8月至2015年1月住院的40例行冠状动脉造影检查，确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者为研究对象，其中男性26例，女性14例，平均年龄（56.7±12.3）岁，病程（3.5±0.6）年。根据临床症状分为冠心病（Coronary heart disease，CHD）组40例，所用患者均排除了肿瘤、结缔组织病、急慢性感染性疾病等可能影响RACK1表达的疾病，另外选择同期体检健康的40例健康者为对照组。

1.2血样采集：所有组患者均空腹采集静脉血后，分别进行实时荧光定量PCR检测和免疫印迹检测。

1.3实时荧光定量PCR（real-time PCR）测定RACK1的mRNA水平：所有患者采集静脉血后，用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，加入1 mL Trizol，提取外周血单个核细胞总RNA。提取RNA后，再经1%琼脂糖凝胶电泳验证和反转录，模板RNA在37 ℃孵育1 h。通过反转录得到的mRNA进行实时PCR扩增，反应条件为：94 ℃预变性30 s，94 ℃ 15 s、59 ℃ 15 s和72 ℃ 30 s（40个循环）。扩增仪为伯乐Icycler定量PCR仪。CT值由PCR仪操作软件给出。

1.4免疫印迹测定RACK1蛋白表达：用淋巴细胞提取液提取外周血单个核细胞，细胞全蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法蛋白定量，各取20 μg，进行12% SDS-PAGE电泳，转PVDF膜。转膜根据预染Mark观察转膜效果。按照相对分子质量大小将PVDF膜裁成适当形状放入含有5 mL/LTween-20的PBST中，洗膜5 min；然后封入含有50 g/L脱脂奶的暗盒中，室温缓慢摇动60 min；PBST洗膜5 min×3次，分别加入按1∶500稀释于PBST的一抗rack1兔mAb（北京博奥森生物技术有限公司）和1∶500抗Actin 兔mAb（北京博奥森生物技术有限公司），4 ℃过夜；PBST洗膜5 min×3次，加入按1∶2000稀释于PBST的二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔，北京博奥森生物技术有限公司），37 ℃缓慢摇动60 min；化学发光法成像。应用图像分析仪测定各条带的吸光度值（A值），以RACK1（A值）/Actin（A值）的结果作为RACK1蛋白表达的相对含量。

1.5统计学分析：应用SPSS17.0软件，多组样本计量资料比较采用单因素方差分析，计数资料的比较采用χ2检验，P＜0.05为有统计学差异。

2　结　果

2.1两组之间患者的年龄、性别、体质量等无统计学差异（P＞0.05）。

2.2实验结果显示外周血单个核细胞中RACK1的mRNA表达，CHD组明显高于对照组（P＞0.01）。外周血单个核细胞中RACK1蛋白的表达，CHD组明显高于对照组（P＞0.01）。见表1。

表1　两组间检测指标结果比较（）

表1　两组间检测指标结果比较（）

注：*P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.01，与对照组比较

组别　例数　RACK1 mRNA　RACK1蛋白CHD组　40　12.56±2.07　3.45±0.87对照组　40　3.13±0.96*　0.76±0.13#

3　讨　论

我们的研究中发现，冠状动脉粥样硬化患者外周血中RACK1的mRNA水平以及蛋白表达均明显高于对照组（P＜0.01），从而提示RACK1表达增多与粥样硬化过程存在相关性。

冠状动脉粥样硬化的发病机制曾有多种学说，包括脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等，分别从不同角度对粥样硬化成因加以阐述，近年来多数学者支持内皮损伤反应学说，其核心内容是各种危险因素最终损伤动脉内膜，在血脂参与下造成内皮、内膜损伤，引起炎症-纤维增生性反应。RACK1参与调节多条炎症信号通路，如JNK，GSK3β。在人单核细胞中通过病毒感染的方法敲低RACK1的含量，RACK1缺失后导致MAPK炎性信号通路中多种蛋白磷酸化水平下降，同时导致NF-κB的上游蛋白激酶磷酸化水平降低，并且影响炎性信号通路中多种蛋白表达水平降低，最终影响了炎性细胞因子IL-6和TNF-α表达下降，从而降低炎性反应。在肿瘤研究中发现，RACK1可在肿瘤细胞的黏附及迁移过程中发挥调节作用［5］，研究发现MAPK和P13K等通路在细胞黏附以及迁移过程中发挥了重要作用，在这些通路中许多重要激酶和磷酸酶的脚手架蛋白正是RACK1［6］。

根据上述研究我们可以推测RACK1在冠状动脉粥样硬化的炎性反应中以及巨噬细胞、平滑肌细胞的迁移过程中也发挥了类似的作用。我们的研究也证实了冠状动脉粥样硬化患者外周血中RACK1从基因和蛋白水平均明显增高。其机制可能是RACK1高表达引起炎性反应中的关键酶活性增高，从而加速了粥样硬化的进展，造成了斑块的不稳定［7-8］。此外，Wang等人在RACK1与肿瘤的研究中发现，RACK1可以通过激活内皮细胞中的P13K、Akt、Rac1通路从而促进肿瘤组织中新生血管的产生［9］。因此我们推测由于在急性冠状动脉综合征（ACS）患者中RACK1有更高的表达，从而可能导致ACS患者粥样硬化斑块中新生血管更加丰富，更易破裂，从而导致板块不稳定。

综上所述，RACK1在冠状动脉粥样硬化的发展过程以及斑块的稳定性性方面可能起到了重要的作用，下一步的研究可以考虑敲低RACK1的含量以进一步观察其对斑块体积以及稳定性的影响。

［1］Del Vecchio I，Zuccotti A，Pisano F，et al.Functional mapping of the promoter region of the GNB2L1 human gene coding for RACK1 scaffold protein［J］.Gene，2009，430（1/2）:17-29.

［2］Wang S，Chen JZ，Zhang Z，et al.Cloning，expression and genomic structure of a novel human GNB2L1 gene，which encodes a receptor of activated protein kinase C（RACK）［J］.Mol Biol Rep，2003，30（1）:53-60.

［3］Nakashima A，Chen L，Thao NP，et al.Rack1 functions in rice innate immunity by interacting with the rac1 immune complex［J］.Plant Cell，2008，20（8）:2265-2279.

［4］Siriker O，Ozer NK，Azzi A.Dietary cholesterol-incluced changes of protein kinase C and the effect of vitamin E in rabbit aortic smooth muscle cells［J］.Atherosclerosis，1996，126（2）:253-263.

［5］Cox EA，Bennin D，Doan AT，et al.RACKl regulates integrinmediated adhesion ，prou'usion ，and chemotactic cell migration via its Src-binding site［J］.Mol Biol Cell，2003，14（2）:658-669.

［6］huang CF，Fan JH，Chuang NN.Farnesyl pyrophosphate promotes and is essential for the binding of RACKl with beta-tubulin ［J］.J Exp Zool A Comp Exp Biol，2003，298（2）:119-127.

［7］陈文一，王红巧，张丰雪.冠心病病人血清IMA与sI-CAM-1变化及意义［J］.青岛大学医学院学报，2009，13（6）:517-518.

［8］孙健玲，黄卫民，王崇禹，等.冠状动脉心肌桥与冠状动脉粥样硬化关系的临床研究［J］ .中国医药导报，2012，3（29）:57-58.

［9］Wang F，Yamauchi M，Muramatsu M，et a1.RACKI regulates VEGF/Flt1-mediated cell migration via activation of a PBK/Akt pathway［J］.J Biol Chem，2011，286（11）:9097-9106.

R541.4

B

1671-8194（2015）16-0059-02

青岛市科技局科研基金资助项目（10-3-3-4-2）

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