血清MMP－9与DMD 骨骼肌纤维化的相关性分析

陈盼盼 李 哲 韩春锡 林婧娴 廖建湘

1）山东滨州市人民医院儿科 滨州 256600 2）山东滨州市人民医院骨科 滨州 256600 3）广东深圳市儿童医院神经内科 深圳 518038 4）广东珠海市人民医院儿科 珠海 519000

杜氏型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是X－连锁隐性遗传病，占活产男婴的1／3 500～1／4 000［1－2］。DMD 患 者 由 于dystrophin基 因 突 变，导 致 肌 纤 维膜上的dystrophin蛋白缺失，从而出现肌纤维变性、坏死、再生，炎细胞浸润，纤维结缔组织和脂肪组织增生。研究表明，改善肌肉纤维化可延缓患者疾病进展，并可通过改变肌纤维的微环境提高基因治疗、干细胞治疗的成功率［3－4］。本研究探讨骨骼肌纤维化与年龄的关系，探讨血清MMP－9与DMD骨骼肌纤维化的关系及作为DMD 病情变化指标的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011－08—2012－06就诊于深圳市儿童医院神经肌肉病专科并通过肌肉病理检查和（或）基因检查诊断为DMD／BMD、且未经药物治疗的50 例患儿（均为男孩）为研究对象，收集患者腓肠肌和非抗凝血资料。其中DMD 组42例，平均年龄（6.55±2.72）岁；BMD 组8 例，平均年龄（8.80±4.17）岁；收集正常对照组非抗凝血18例，平均年龄（8.07±3.86）岁。DMD 组又根据年龄分为3组，其中＜5岁组13例，5～9岁组21例，＞9 岁组8例。收集的肌肉标本均来自于肌活检。本研究标本收集均经患儿家长同意，并签写知情同意书。

1.2 方法 行HE染色观察骨骼肌基本病理改变，Masson染色观察骨骼肌纤维化程度，免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结（SP）法观察MMP－9在肌肉组织中的分布情况；并对行DMD、BMD 及正常对照组行ELISA 法行血清MMP－9浓度测定。

2 结果

2.1 各组骨骼肌比较 DMD 组骨骼肌中可见纤维组织增生，其中＜5岁组DMD 患者骨骼肌纤维组织增生不明显，5～9 岁组DMD 骨骼肌纤维组织增生明显（图1），＞9 岁组DMD 骨骼肌纤维组织增生明显，且肌纤维数量明显减少。BMD 对照组未见明显纤维组织增生。除可见纤维化组织增生情况外，＜5岁组DMD 骨骼肌可见肌束间界限欠清，较多萎缩、肥大、变性、坏死肌纤维和以及少量再生肌纤维；5～9岁组DMD 骨骼肌肌束间界限欠清，大量萎缩、肥大、变性、坏死以及少量再生肌纤维（图2）；＞9岁组DMD 骨骼肌肌束间界限欠清，大量萎缩、肥大、变性、坏死肌纤维，少量再生肌纤维。BMD 对照组骨骼肌肌束间界限清，较多萎缩、肥大、变性、坏死以及再生肌纤维。

图1 DMD MASSON染色×100

图2 DMD HE染色×100

2.2 各组纤维化程度通过胶原纤维／（胶原纤维＋肌纤维）面积百分比比较 DMD 组纤维化程度均值为（40.29±15.27）%，明 显 高 于BMD 对 照 组（20.04±8.50）%（t＝3.653，P＜0.05）。见表1。DMD＜5 岁组、5～9 岁组、＞9岁组相比，纤维化程度逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。采用Pearson线性相关与回归分析DMD 组纤维化程度与年龄的关系，结果提示胶原纤维含量随患儿年龄的增长而增加，两者成正相关（r＝0.6721，P＜0.05）。

表1 DMD 组、BMD 对照组纤维化程度测量结果比较

表1 DMD 组、BMD 对照组纤维化程度测量结果比较

注：2组数据均近似正态分布，经两独立样本t检验，F＝2.457，P＝0.124，方差齐，t＝3.653，P＝0.001

组别 n 年龄／岁 纤维化程度DMD 组42 6.56±2.69 40.29±15.27 BMD 对照组8 8.80±4.46 20.04±8.50

表2 DMD 各组纤维化程度测定结果比较

表2 DMD 各组纤维化程度测定结果比较

注：三组数据都近似正态分布。经单因素方差分析，方差齐，P＝0.293，总体分析，F＝18.643，P＝0.000

组别 n 年龄／岁 纤维化程度／%＜5岁组13 3.48±0.28 30.53±10.26 5～9岁组 21 6.83±0.94 39.79±11.89＞9岁组8 10.81±0.93 59.59±13.65

2.3 α－SMA 是肌成纤维细胞的特异性标记物，图3b 示DMD 骨骼肌中存在肌成纤维细胞。CD68标记巨噬细胞，在DMD 骨骼肌中，巨噬细胞浸润，且坏死肌纤维周围多见。MMP－9存在于DMD 骨骼肌中，且在巨细胞浸润的部位表达较强。

图3a DMD 阴性对照×200

图3b DMDα－SMA染色×200

图3c DMD CD68染色×200

图3d DMD MMP－9染色×200

2.4 各 组MMP－9 浓 度 比 较 DMD 组、BMD 对 照 组 血 清MMP－9浓度比正常对照组明显升高，且DMD 组血清MMP－9浓度升高最明显，3组血清MMP－9浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在DMD 患者中，＞9岁组、5～9岁组与＜5岁组相比血清MMP－9均升高（P＜0.05）；＞9岁组与5～9岁组相比，血清MMP－9略下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、表4。经Pearson相关分析，9岁前的DMD患者，血清MMP－9与年龄正相关（r＝0.6118，P＜0.05）。

表3 DMD 组、BMD 对 照 组、正 常 对 照 组 血 清MMP－9浓度测定结果

表3 DMD 组、BMD 对 照 组、正 常 对 照 组 血 清MMP－9浓度测定结果

注：近似正态分布，经单因素方差分析，方差不齐，P＝0.000，总体分析F＝46.398，P＝0.000

组别 n 年龄（岁） MMP－9（ng／mL）DMD 组42 6.56±2.69 742.37±309.12 BMD 对照组 8 8.80±4.47 286.94±82.95正常对照组18 8.07±3.86 89.93±41.27

表4 DMD各组血清MMP－9浓度测定结果及P值表

表4 DMD各组血清MMP－9浓度测定结果及P值表

注：近似正态分布，经单因素方差分析，方差齐，P＝0.241，总体分析F＝8.873，P＝0.001

组别 n 年龄／岁 MMP－9（ng／mL）＜5岁组13 3.48±0.28 499.83±205.52 5～9岁组 21 6.83±0.94 887.07±310.77＞9岁组8 10.81±0.93 756.69±229.55

3 讨论

本研究采用Masson染色观察、测定纤维化程度。目前，Masson染色是检测纤维化最常用的病理方法，该方法成熟、可靠、方便，并广泛应用于肝肾纤维化、骨骼肌纤维化、mdx小鼠心肌纤维化等纤维化疾病的测定中［5－6］。对DMD、BMD患者的冰冻肌肉组织进行Masson染色，染色后胶原纤维呈现蓝色，肌纤维呈现红色，容易区分，便于纤维化程度的计算。

本研究中，DMD 与贝克型肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）的纤维化严重程度不同。DMD 组纤维化程度较BMD 组明显升高（P＜0.05），这与DMD、BMD 的发病机制相关。在DMD 中，dystrophin基因发生框移突变，导致合成的dystrophin蛋白缺失C末端，而且dystrophin蛋白的含量不足正常人的3%，dystrophin－C、N、R 免疫组化染色多为0～2级。在BMD 中，dystrophin基因突变并不改变翻译阅读框架，产生的dystrophin蛋白保留C 末端，合成dystrophin蛋白功能降低，且dystrophin－C、N、R 免疫组化染色多为3～4级［1，7－8］。dystrophin蛋白的缺失使细胞膜结构不完整、功能受损，这导致肌细胞变性坏死、炎细胞浸润、纤维结缔组织增生［9］。DMD 患者dystrophin蛋白缺失严重，其肌纤维结构功能受影响较大，因此，在DMD 中可见较多变性、坏死、再生肌纤维。BMD 患者中dystrophin蛋白含量较多，对肌纤维结构和功能的影响较小，细胞坏死发生的较缓慢，炎性反应、纤维化程度较DMD 轻［10］。由于BMD 患者与DMD患者的发病机制类似，病理改变的特点密切相关，故本研究在观察DMD 组纤维化程度时，选用BMD 早期患者作为对照组。

本研究观察DMD 患者Masson染色，发现＜5岁组者纤维结缔组织增生不明显，5～9 岁组肌纤维结缔组织增生明显，＞9岁组纤维结缔组织增生最明显，且DMD 骨骼肌纤维化程度随年龄的增加而加重（r＝0.6721，P＜0.05），表明随着年龄的增加，DMD 肌纤维逐渐被纤维结缔组织取代，骨骼肌病理变化越来越严重。大量研究表明［1，11］，在DMD 中，骨骼肌病理改变的严重程度与年龄相关，在年幼患儿中肌肉病理改变较轻，在年龄大的患儿中病理改变较重，其中纤维化程度随着年龄的增加逐渐加重，与本研究结果一致。

MMP－9作为一种分泌蛋白，由受损的肌肉及炎性细胞释放，存在于mdx小鼠骨骼肌的肌纤维及其周围组织表明，且巨噬细胞密度高的地方，MMP－9水平也较高［12］。在本研究中，MMP－9存在于DMD 骨骼肌组织中，且巨噬细胞密度高的地方表达较强，与MMP－9在mdx小鼠骨骼肌中的分布相符。

本研究中，除了DMD 组、BMD 对照组血清MMP－9浓度均比正常对照组高外，DMD 组血清MMP－9浓度比BMD对照组高（P＜0.05），且DMD 组纤维化程度比BMD 组高，这表明血清MMP－9浓度可能与纤维化程度有关。国外研究报道，生后6周、8周的mdx小鼠与同龄wt小鼠相比，血清MMP－9浓 度 升 高［13－14］，些 研 究 均 表 明MMP－9与mdx小 鼠骨骼肌纤维化有关，与本研究结果相符。

DMD＞9岁组、5～9岁组与＜5岁组相比，血清MMP－9浓度较高（P＜0.05），＞9 岁组与5～9 岁组相比，血清MMP－9略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。在第8到14周的mdx小鼠中，血清MMP－9水平在随mdx小鼠年龄的增加而下降［13］，而本研究中＞9岁组与5～9岁组差异无统计学意义，这可能与mdx小鼠与DMD 患者的病理改变程度不同有关。

本研究中，可见DMD5～9岁组血清MMP－9浓度均比＜5岁组较高，且9岁之前，DMD 血清MMP－9（r＝0.6118，P＜0.05）浓度随年龄的增加而升高。DMD 患者纤维化程度随年龄的增加而加重，因此，我们推断DMD 在9岁之前，血清MMP－9浓度随纤维化程度的加重而升高。Nadarajab VD等［13］以接受了糖皮质激素治疗的DMD 患者为研究对象，发现血清MMP－9浓度随年龄的增长而增加，这可能与糖皮质激素有关。在其他疾病中，糖皮质激素可使血清MMP－9水平降低［15］，或 先 升 高 后 降 低［16］，亦 有 研 究 表 明 无 明 显 影响［17］；在Nadarajab VD 等［13］的 研 究 中，不 仅 应 用 了 糖 皮 质激素且治疗时间长短不一，不能完全排除糖皮质激素治疗对研究结果的影响。Hughes等［53］指出，在DMD 中，糖皮质激素可能通过钙调磷酸酶／NF－AT（nuclear factor of activated T－cell，NF－AT）途径减缓DMD 肌纤维化的病理过程，这可能会影响MMP－9水平。因此，本实验中选择未经过经过糖皮质激素治疗的DMD 患者为研究对象，结果可以排除糖皮质激素的影响。

本研究表明，DMD 患者血清MMP－9 浓度升高，且在DMD 患者9岁之前，血清MMP－9浓度随年龄的增长、纤维化程度的增加而升高。因此，血清MMP－9浓度可与其他指标共同作为评估DMD 病情变化的重要指标，尤其是作为评估早中期DMD 病情变化的评估指标，以及作为评估DMD早期治疗效果的评估指标。

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