甘草渣黄酮回流提取的工艺优化及预处理方法研究

徐春燕，张　娜，韩爱荣，管翠萍（宁夏大学生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021）

甘草渣黄酮回流提取的工艺优化及预处理方法研究

徐春燕，张娜，韩爱荣，管翠萍
（宁夏大学生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021）

通过单因素实验考察了乙醇浓度、温度、时间、固液比对甘草渣中黄酮提取的影响，在此基础上采用正交实验设计L9（34）优化黄酮提取工艺，获得了乙醇回流提取甘草渣中黄酮的最佳条件为：乙醇浓度80%、温度80℃、时间105min、固液比1∶20（g/mL），最佳条件下黄酮得率为37.387mg/g。进一步采用酶法和微生物法分别对甘草渣进行预处理，结果表明，酶法预处理能显著提高黄酮得率，纤维素酶与木聚糖酶协同作用效果最佳；黄孢原毛平革菌处理12d的黄酮得率最高，达45.38mg/g。微生物预处理不但显著提高黄酮得率，而且显著（p＜0.05）降低了乙醇浓度和提取温度，缩短了提取时间。此研究对于甘草渣的综合开发和利用具有重要的参考价值。

甘草渣，总黄酮，正交实验，酶法预处理，微生物预处理

甘草为多年生豆科草本植物，是一种重要的中草药，其化学成分十分复杂，其中主要成分为甘草酸和甘草苷［1-2］。有效成分提取是甘草资源开发利用的重要方向，在提取甘草酸等有效成分后剩余大量残渣，多以垃圾倒掉，造成环境污染的同时也引起了宝贵资源的浪费。有研究表明甘草渣营养丰富，可用于栽培食用菌［3］、提取黄酮类化合物［4］等，来自于甘草废渣的有效成分价值甚至高于甘草中的有效成分［5］。因此，将甘草渣变废为宝的综合利用技术是解决甘草资源有效利用的关键点之一。

甘草渣中含有的黄酮类化合物因具有抗肿瘤等多种功效而存在巨大的药用价值和商业价值［4-6］，因此，从甘草渣中提取黄酮类化合物将显著提高甘草资源的经济价值。但是，甘草渣中大部分黄酮类化合物存在于细胞壁内，细胞壁对黄酮类化合物起到天然屏障作用，传统的溶剂提取效率较低［7］，在提取前增加预处理工艺将促进黄酮类化合物溶出，从而提高黄酮得率。酶法和微生物法预处理特异性强，处理条件温和、污染小［8-9］，近几年很受重视。本文以甘草渣为原料，通过正交实验获得黄酮类化合物的最佳乙醇回流提取工艺，在此基础上分别采用三株白腐真菌和三种酶预处理甘草渣，比较微生物与酶法预处理对甘草渣黄酮得率的影响，为甘草渣综合利用提供实践基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

甘草渣来自于宁夏平罗县乐夏甘草制品有限责任公司，为提取生产甘草浸膏后的废弃物，经粉碎后过筛分级，选取粒度小于0.9mm的部分作为实验材料，存放于干燥器内备用；黄孢原毛平革菌来自美国模式培养物集存库，编号PC；BBEL0901和BBEL0970分离自美国奥林匹克国家公园，由本实验室保存，经分子鉴定分别为胶质射脉革菌和杂色云芝，其ITS序列的Genbank登录号分别为KM819088和KM819087；纤维素酶和木聚糖酶由宁夏夏盛实业集团有限公司惠赠，经测定纤维素酶活性约为64FPU/g，木聚糖酶活性约为200U/g；漆酶粗酶液为本实验室所制备，由BBEL0901液体发酵液离心所得，漆酶活性为235U/mL；培养基为PDA培养基、PDB培养基和甘草渣培养基甘草渣10g，营养液［10］15mL。

U-T6型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；AL204型分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H1850型高速离心机湘仪离心机仪器有限公司；LRH-250型生化培养箱上海一恒仪器有限公司；HH-3A型数显恒温水浴锅金坛市精达仪器制造厂；QHZ-12B型组合式全温振荡培养箱太仓市华美生化仪器厂；SW-CJ-1F型洁净工作台苏净集团安泰公司；回流提取装置。

1.2实验方法

1.2.1单因素实验选用乙醇回流法提取甘草渣中的黄酮，以提取温度、固液比、提取时间、乙醇浓度为单因素，通过实验确定每种因素中较优的水平，提取结束后冷却提取液至室温，过滤除去滤渣，测定提取液中黄酮含量。每个样品做3个平行样，结果取其平均值。

1.2.1.1温度固定乙醇浓度为80%，固液比为1∶40（g/mL），提取时间为90min，设置提取温度分别为55、65、75、85、95℃。

1.2.1.2提取时间固定乙醇浓度为80%，固液比为1∶40（g/mL），提取温度为75℃，设置提取时间分别为30、45、60、90、120、150min。

1.2.1.3乙醇浓度固定提取温度为75℃，提取时间为90min，固液比为1∶40（g/mL），设置乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%。

1.2.1.4固液比固定乙醇浓度为80%，提取温度为75℃，提取时间为90min，设置固液比（g/mL）分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。

1.2.2正交实验为了同时考察各因素对甘草渣黄酮提取的影响，在单因素实验的基础上，选取四因素的合适水平设计正交实验提取黄酮，并采用极差分析法对草渣黄酮提取工艺进行优化。正交实验的因素和水平见表1。

表1　L9（34）正交实验的因素水平表Table 1　Factors and levels in the L9（34）orthogonal design

1.2.3甘草渣的酶法预处理分别采用漆酶、纤维素酶、半纤维素酶等以1∶40（g/mL）的甘草渣-酶液比于45℃处理甘草渣样品，处理后离心，固体残渣于80℃条件下烘48h称重，采用1.2.2正交实验所获得的最佳工艺提取黄酮并计算其得率。实验分组为：对照组，pH4.8的醋酸-醋酸钠液（50mmol/L）处理24h；L组：漆酶粗酶液处理24h；C组：2.5%纤维素酶液处理24h；CX组：纤维素酶和木聚糖酶混合酶液处理24h，其配制方法为：向pH4.8的醋酸-醋酸钠液（50mmmol/L）中添加2.5%纤维素酶和2.5%木聚糖酶；LCX同步组：漆酶、纤维素酶、木聚糖酶混合酶液处理24h，其配制方法为：向漆酶粗酶液（漆酶活性为235U/mL）中添加2.5%纤维素酶和2.5%木聚糖酶；LCX分步组：先用漆酶粗酶液处理24h，离心弃上清，再用纤维素酶和木聚糖酶混合酶液处理离心后的固体残渣24h，纤维素酶和木聚糖酶混合酶液配制方法为：向pH4.8的醋酸-醋酸钠液（50mmmol/L）中添加2.5%纤维素酶和2.5%木聚糖酶。

SPF级SD大鼠（远交群），7～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2012‐0001，动物质量合格证编号11400700179271、11400700161162、37009200004448、37009200004448、11400700202471。

1.2.4甘草渣的微生物预处理将三株白腐真菌菌种接入PDA培养基中于28℃活化后挑取菌块，接种于PDB液体培养基中28℃、150r/min培养5～7d制种。分别接9mL液体菌种至甘草渣培养基，于28℃进行固态发酵，待菌丝充满固体基质后提取第一批发酵样品，之后定期取样5批次。其中PC和BBEL0970的发酵周期24d，每4d取样一次；BBEL0901的发酵周期为32d，每4～7d取样一次。取样后于80℃下烘48h后称重，采用1.2.2正交实验所获得的最佳工艺提取黄酮。

1.2.5微生物预处理对黄酮提取条件的影响以PC处理12d的甘草渣样品为材料，在正交实验得到的最佳工艺基础上，按照弱化提取条件的原则分别将温度、乙醇浓度和提取时间降低一个水平，设计A～D 4种不同条件提取黄酮，通过对比不同提取条件下的黄酮得率来研究微生物预处理对黄酮提取条件的影响。A为正交设计得到的最佳工艺，B将最佳工艺中的提取时间缩短为90min，C将最佳工艺中的乙醇浓度降低至75%，D将最佳工艺中的提取温度降低至70℃。

1.3测定方法

1.3.1黄酮含量的测定以0.4mg/mL芦丁为标准溶液，分别移取标准溶液0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、5mL，分别以蒸馏水补足5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.5mL，摇匀、静置6min，加入10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀、静止6min，再加4%氢氧化钠溶液4mL，摇匀、静置15min，510nm处测吸光值，以吸光值为横坐标，以标准品浓度为横坐标制作标准曲线。所得回归方程为y=0.3896x+0.0015（x：OD510nm，y：待测液浓度，单位mg/mL），相关系数R2=0.9992。按上述方法测定待测液在510nm处吸光值，通过芦丁标准曲线计算黄酮含量。

1.3.2黄酮提取得率的计算根据各提取液中的黄酮含量计算各样品的黄酮提取得率，公式为：黄酮得率（mg/g）=（V×C）/W，其中C为提取液中黄酮含量（mg/mL），V为提取液总体积（mL），W为甘草渣质量（g）。

1.4数据处理

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，结果以平均值±标准误差（M±SE）表示，采用Origin 8.6软件进行作图，对各组结果进行统计学Duncan检验比较差异，以不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。

2　结果与分析

图1　温度对黄酮提取得率的影响Fig.1　Effect of temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1温度对黄酮提取得率的影响由图1可知，黄酮得率随着提取温度升高呈上升趋势，这是由于温度升高有利于样品中黄酮类化合物扩散到溶剂中。但是，提取温度为95℃时黄酮的得率不升反降，这可能是因为黄酮类化合物化学稳定性较差，高温下黄酮成分损失较大［8-9］。方差分析表明75℃与85℃下的黄酮得率无显著性差异（p=0.584＞α=0.05），从减少能耗方面考虑，选择75℃为乙醇回流提取甘草渣黄酮的最佳温度，得率为34.039mg/g。

图2　提取时间对黄酮提取得率的影响Fig.2　Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2提取时间对黄酮提取得率的影响由图2可以看出，随着提取时间延长，黄酮得率增加，但提取时间超过120min时，黄酮得率反而有所下降。这可能是因为延长提取时间有利于黄酮类化合物彻底扩散至提取溶剂中，但另一方面由于黄酮类化合物较低的稳定性［8-9］，提取时间过长使得黄酮提取得率降低。方差分析表明提取90min与120min的黄酮得率差异不显著，从缩短提取时间、减少能耗方面考虑，确定90min为乙醇回流提取甘草渣黄酮的最佳时间，此时，黄酮得率为35.177mg/g。

图3　乙醇浓度对黄酮提取得率的影响Fig.3　Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3乙醇浓度对黄酮提取得率的影响从图3可知，随着乙醇浓度增加，黄酮的提取得率显著升高，但当乙醇浓度达到90%时，黄酮得率反而下降。这是因为有机溶剂的增加有利于样品中黄酮类化合物的释放，但乙醇浓度过高使得提取液沸点越低，在提取过程中挥发的也越快，对提取得率不利。因此，选择80%乙醇为回流提取甘草渣黄酮的最佳溶剂浓度，此溶剂溶度下黄酮得率为34.441mg/g。

图4　固液比对黄酮提取得率的影响Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4固液比对黄酮提取得率的影响由图4可知，固液比从1∶10（g/mL）提高到1∶20（g/mL）时，黄酮得率显著提高，从21.763mg/g提高至34.039mg/g，提高了56.4%。而当固液比从1∶20（g/mL）继续增加到1∶50（g/mL）时，黄酮得率基本维持不变，说明继续增加固液比对黄酮的提取无影响，因此提取的最佳固液比为1∶20（g/mL）。

表2　正交实验的结果与直观分析表Table 2　Results and analysis of the orthogonal design

2.2正交实验

根据单因素实验结果，选择4个影响因素的3个水平设计正交实验L9（34）优化甘草渣中黄酮乙醇回流提取的工艺，考察指标为黄酮得率，正交实验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表3　正交实验的方差分析表Table 3　Variance analysis of the orthogonal design

从表2和表3可知，各单因素对甘草渣中黄酮提取得率的影响程度依次是C＞A＞B＞D，即四因素中乙醇浓度对黄酮得率的影响最显著，其次为温度、固液比、提取时间。从方差分析表3可知，乙醇浓度和温度对黄酮得率具有显著意义，固液比和提取时间对黄酮得率具有一般意义。根据表2中的最优水平确定甘草渣中黄酮提取的最优工艺组合为A3B2C2D3，即温度80℃，固液比1∶20（g/mL），乙醇浓度80%，提取时间105min。

以上述最佳工艺条件进行验证实验，结果表明，最优工艺下黄酮提取得率为37.387mg/g，RSD=1.8%（n=3），说明该工艺条件为最佳选择，工艺稳定可行。

2.3酶法预处理对黄酮得率的影响

酶法预处理对甘草渣黄酮得率的影响如图5所示，与对照组相比，除LCX同步组外，其他几组酶法预处理均能有效提高甘草渣中黄酮得率，提高幅度介于27.7%～56.6%之间。CX组即纤维素酶与木聚糖酶协同作用的效果最佳，黄酮提取得率达27.1mg/g，比对照组提高了56.6%，说明纤维素酶与半纤维素酶复合处理有利于促进甘草渣中黄酮的提取。但是，酶法预处理中，甘草渣因在酶液中浸泡24h，使水溶性黄酮转移到上清液中被弃去［11］，因此黄酮提取得率整体比原料降低。纤维素酶单独处理甘草渣后黄酮得率与漆酶单独处理的效果相当，将漆酶、纤维素酶和半纤维素酶分步处理甘草渣（LCX分步组）没有进一步提高黄酮得率，而LCX同步组与对照没有显著性差异可能是由于木质素对纤维素酶的不可逆失活使纤维素酶活性降低［12-13］。此外，虽然漆酶常被用于中药材中有效成分的提取，但是漆酶在介体的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，导致黄酮类化合物降解［14］。

图5　酶法预处理对甘草渣黄酮提取得率的影响Fig.5　Effect of enzymatic pretreatment on the extraction yield of total flavonoids

2.4微生物预处理对黄酮得率的影响

微生物预处理对甘草渣黄酮得率的影响如图6所示，BBEL0901和BBEL0970处理甘草渣不同时间均使其黄酮提取得率大幅度降低，PC处理使黄酮得率显著升高，其中PC处理12d使黄酮提取得率提高最多，比原料提高了21.4%，达45.38mg/g（相当于含量为4.54%），远远高于李艳宾等所报道1.18%的含量［15］。BBEL0901和BBEL0970分别属于木质素选择性降解菌和同步降解菌，两者都具有较强的漆酶产生能力，PC是模式真菌，不产漆酶，主要通过分泌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和乙二醛氧化酶降解木质素［16］，推测通过固体发酵形式进行的微生物预处理过程中，由于漆酶形成的高活性中间体对黄酮类化合物的降解作用较大，掩盖了白腐真菌破坏细胞壁结构对黄酮溶出形成的促进作用，综合导致产漆酶白腐真菌预处理后黄酮提取效果下降。

2.5微生物预处理对黄酮提取条件的影响

进一步对PC处理12d样品的提取条件进行研究，结果如图7所示。由图7可见，在4种条件下提取PC处理12d甘草渣样品的黄酮得率无显著性差异，且显著高于未经处理的原料，说明白腐真菌PC处理甘草渣不但能够显著提高黄酮得率，而且能够降低乙醇浓度和提取温度，缩短提取时间。此外，PC是白腐真菌研究中常用的模式菌，在菌丝生长阶段能够产生粉孢子，有利于实现微生物预处理缩短黄酮提取时间的工业化应用。

图6　微生物预处理不同时间的甘草渣中黄酮提取得率Fig.6　Effect of microbial pretreatment on the extraction yield of total flavonoids

图7　不同提取条件下PC处理12d样品的黄酮得率Fig.7　The extraction yield of total flavonoids of the 12d pretreated sample by PC under different extraction condition

3　结论

在单因素实验的基础上采用正交实验设计L9（34）优化黄酮提取工艺，获得了乙醇回流提取甘草渣中黄酮的最佳条件：乙醇浓度80%，温度80℃，固液比1∶20（g/mL），时间105min，此条件下黄酮得率为37.387mg/g。在此基础上，分别采用酶法和微生物法对甘草渣进行预处理，发现酶法预处理能显著提高黄酮提取得率，纤维素酶与木聚糖酶协同作用效果最佳；黄孢原毛平革菌处理12d的黄酮提取得率最高，达45.38mg/g。黄孢原毛平革菌不但显著提高黄酮得率，而且显著降低了乙醇浓度和提取温度，缩短了提取时间。

［1］Asl MN，Hosseinzadeh H.Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp.and its bioactive compounds［J］.Phytotherapy Research，2008，22：709-724.

［2］段志涛，高英，李卫民，等.甘草中黄酮类成分的研究［J］.北方药学，2013，10（7）：6-11.

［3］陈学强，余梦瑶，郑林用.新型栽培基质生产食用菌的研究进展［J］.中国食用菌，2009，28（3）：7-9.

［4］杨琳，车庆明，毕诚，等.甘草废渣中黄酮成分的研究［J］.中草药，2007，38（5）：671-673.

［5］邓丽.甘草渣中黄酮类化合物的提取纯化、分离鉴定及其抑菌活性研究［D］.兰州：兰州理工大学，2011.

［6］刘芬，李宁，倪慧，等.甘草药渣的研究进展［J］.中国现代中药，2011，13（2）：6-9.

［7］乔仲和，胡自如.甘草渣中大量黄酮类化合物的分离及甘草的综合开发研究［J］.中草药，1997（9）：522-524.

［8］Chandra RP，Bura R，Mabee WE，et al.Substrate pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics［J］. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology，2007，108：67-93.

［9］Lee J.Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol［J］.Journal of Biotechnology，1997，56（1）：1-24.

［10］徐春燕.生物质白腐菌改性与抗性变化的关系研究［D］.武汉：华中科技大学，2009.

［11］田庆来，谢渝春，张波，等.溶剂萃取法分离水溶性甘草黄酮［J］.过程工程学报，2007，7（3）：496-500.

［12］Öhgren K，Bura R，Saddler J，et al.Effect of hemicellulose and lignin removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover［J］.Bioresource Technology，2007，98（13）：2503-2510.

［13］徐春燕，马富英，王锦锦，等.生物处理竹子对纤维素酶糖化的影响［J］.林业科学，2008，44（10）：168-172.

［14］李泰仑，杜美惠，刘哲君，等.漆酶在药物生产中的应用进展［J］.黑龙江医药，2010，23（2）：173-174.

［15］李艳宾，张琴，贺江舟，等.云芝发酵处理对甘草渣中总黄酮提取的影响［J］.食品科学，2010，31（11）：182-186.

［16］Zhi Z，Wang H.White-rot fungal pretreatment of wheat strawwithPhanerochaetechrysosporiumforbiohydrogen production：simultaneous saccharification and fermentation［J］. Bioprocess and Biosystems Engineering，2014，37（7）：1447-1458.

Study on pretreatments and optimization on reflux extraction of total flavonoids from glycyrrhiza residue

XU Chun-yan，ZHANG Na，HAN Ai-rong，GUAN Cui-ping
（Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China，School of Life Sciences，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

The effects of extracting temperature，extracting time，ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids from glycyrrhiza residue were investigated by single factor experiments. Based on single factor experiments，optimum parameters for extraction were selected with a L9（34）form by orthogonal experiment design.Results showed that the optimized extraction conditions were as follows：80%（V/V）ethanol，80℃，1∶20（g/mL）solid-liquid ratio，and 105min extraction time，under which the maximum extraction yield of total flavonoids was 37.387mg/g.Enzymatic pretreatment and microbial pretreatment of glycyrrhiza residue were further performed，respectively.Results indicated the extraction yield of total flavonoids was indeed enhanced by enzymatic pretreatments，among which the pretreatment with the combination of celluluase and xylanase gave the best effect.For biological pretreatments，the extraction yield of total flavonoids was the highest after pretreatment by Phanerochaete chrysosporium for 12 days，reaching 45.38mg/g.Moreover，comparison of all the pretreatments revealed that microbial pretreatment not only enhanced the extraction yield of total flavonoids significantly，but also decreased the ethanol concentration，extracting temperature and time. The research had significant reference value for comprehensive development and utilization of glycyrrhiza residue. Key words：glycyrrhiza residue；total flavonoids；orthogonal experiment design；enzymatic pretreatment；microbial pretreatment

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.039

2014－08－18

徐春燕（1981-），女，博士研究生，研究方向：微生物生物技术。

宁夏自然科学基金项目（NZ12128）。