响应面法优化薄荷全草总黄酮的提取工艺

高丹丹，郭鹏辉，祁高展，温海超（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

响应面法优化薄荷全草总黄酮的提取工艺

高丹丹，郭鹏辉，祁高展，温海超
（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

以薄荷为材料，采用超声波辅助法提取薄荷全草总黄酮，研究乙醇体积分数、超声波处理时长、料液比、水浴温度对提取率的影响，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化薄荷全草总黄酮的提取工艺条件，得最佳提取工艺，即：乙醇体积分数50%、料液比1∶20、水浴温度50℃、超声波提取时间30min，在此工艺下总黄酮提取率为3.11%± 0.06%。

薄荷，总黄酮，超声波，响应面法

薄荷（Mentha haplocalyx）为被子植物门、双子叶植物纲、唇形目、唇形科、薄荷属多年生宿根性草本植物，主要生长于水旁、潮湿地，对环境适应性较强。薄荷是一味传统中药，可治疗感冒发热、喉痛、头痛、目赤痛、皮肤风疹搔痒、麻疹不透等症，此外对痈、疽、疥、癣、漆疮亦有效［1］。薄荷可制作菜肴，做凉拌菜和烤肉的调味料，可作食品添加剂，用于糖果、清凉食品饮料、牙膏、漱口水、喷雾香精等制品［2］。研究表明薄荷的水提物对酪氨酸酶有较好的激活作用，能促进毛发中黑色素的生成，有乌发作用，可用于化妆品［3］。薄荷提取物成分还有防晒［4］、抗衰老、去臭以及清凉作用，并能对某些细菌抑制其繁殖和杀死部分细菌及霉菌，故对于头痒和头屑过多的症状有一定的治疗作用［7］。薄荷中黄酮类化合物具有抗氧化［5］、抗肿瘤及抑菌作用［6］。由于薄荷黄酮有多种生物活性，成为研究和开发利用的热点。目前国内对薄荷黄酮提取的研究报道的不多，有研究采用正交的方法优化了薄荷总黄酮的提取工艺［7-9］，侯学敏等［10］采用响应面法优化薄荷叶总黄酮提取工艺，并研究其抗氧化活性。他们的研究获得较高的黄酮提取率，但是他们采用四因素三水平的响应面分析，最终模型的R2为0.8327，拟合度不是很好。在实际的生产和开发中，人们大多采用机器收割的方式获得薄荷全草，获得薄荷叶的成本较高，本研究在单因素的基础上采用响应面法对薄荷全草总黄酮提取工艺进行优化，去掉对实验影响不显著的因素，使得模型的拟合度更好，获得更加可信的工艺条件，为薄荷进一步研究及开发利用，提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

野生薄荷全草采自江西吉安井冈山；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇均为国产分析纯；芦丁标准品购自阿拉丁公司。

微型植物试样粉碎机北京科伟永兴仪器有限公司；FAZ204B型电子天平上海精密科学仪器有限公司；酒精计河北省河间市黎民居标准仪表厂；HWS28型电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗机上海声彦超声波仪器有限公司；水流抽气机上海爱朗仪器有限公司；722E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品预处理将薄荷全草（水分含量4.72%）用微型植物试样粉碎机粉碎，过60目筛备用。

1.2.2总黄酮含量的测定

1.2.2.1芦丁标准曲线制备准确称取5.0mg芦丁标准品，用30%乙醇溶解，定容至50mL，配成0.1mg/mL芦丁标准溶液。精密移取0.0、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL芦丁标准溶液置于10mL比色管中，用30%乙醇溶液定至5.0mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，静置6min；加入10%硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，用30%乙醇定容至10.0mL，静置15min。在510nm处测定其吸光度，绘制芦丁标准曲线。

1.2.2.2样品测定准确移取1mL待测样品于10mL比色管中，加30%乙醇溶液定容至5mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，静置6min；加入10%硝酸铝溶液0.3mL，静置6min；加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，用30%乙醇定至10.0mL，静置15min，在510nm处测定其吸光度。根据芦丁标准曲线，按下式计算样品中总黄酮的提取率：

式中，C：标准曲线计算得到的总黄酮浓度（mg/mL）；V1：待测液总体积（mL）；V2：测试液定容体积（mL）；V3：测试液体积（mL）；M：称取薄荷样品的质量（g）。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1料液比对提取率的影响准确称取1.0000g薄荷置于试剂瓶中，分别加入10、20、30、40、50mL的50%乙醇溶液，60℃恒温水浴1h，超声处理40min，抽滤，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法测定其提取率，每组实验重复三次。

1.2.3.2乙醇体积浓度对提取率的影响准确称取1.0000g薄荷置于试剂瓶中，分别加入30%、40%、50%、60%、70%体积浓度的乙醇溶液20mL，在60℃恒温水浴锅中水浴1h，放入超声波清洗机中超声处理40min，抽滤，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法测定其提取率，每组实验重复三次。

1.2.3.3水浴温度对提取率的影响准确称取1.0000g薄荷置于试剂瓶中，加入50%乙醇溶液20mL，分别在40、50、60、70、80℃恒温水浴锅中水浴1h，放入超声波清洗机中超声处理40min，抽滤，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法测定其提取率，每组实验重复三次。

1.2.3.4超声时间对提取率的影响准确称取1.0000g薄荷置于试剂瓶中，加入50%乙醇溶液20mL，60℃恒温水浴1h，放入超声波清洗机中，分别超声处理20、30、40、50、60min，抽滤，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法测定其提取率，每组实验重复三次。

1.2.4响应面实验设计根据单因素实验得到的结果，采用响应面法设计实验，运用Box-Behnken的中心组合实验，选择对薄荷总黄酮提取具有显著影响的三个因素：乙醇浓度（A）、水浴温度（B）和超声时间（C），采用三因素三水平的响应面实验设计，见表1。

1.2.5数据分析采用F检验对响应面实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义，数据分析软件采用Design Expert 8.0。

2　结果与分析

2.1标准曲线绘制

芦丁标准曲线以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制芦丁标准品的散点图，制得如图1所示，回归方程为：y=14.401x+0.0066，R2= 0.999。表明芦丁标准品在浓度为0.01～0.05mg/mL范围内线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　The standard curve of Rufin

2.2单因素分析

2.2.1料液比对薄荷总黄酮提取率的影响由图2可知，薄荷总黄酮提取率在料液比1∶10～1∶20之间，料液比增加，总黄酮提取率随之增加，这可能是因为增加溶剂，增加了薄荷粉与溶剂接触面的浓度差，提高了传质速率［7］。在超声波提取下，当增加溶剂时，细胞破碎完全，总黄酮充分溶解。

料液比达到1∶20以后，薄荷中总黄酮已经充分溶解，提取率趋于稳定，总黄酮提取率随料液比增加而趋于稳定。当料液比达到1∶50时，总黄酮提取率稍有减少。可能是由于溶剂过多时，有可能使其他物质渗出，使溶液黏度增加，影响薄荷黄酮的提取。同时，溶剂使用量较大，溶剂本身对超声波有一定的吸收损耗［11］。考虑到节约溶剂和提取效率，选择料液比为1∶20为最佳提取料液比。

图2　料液比对薄荷总黄酮提取的影响Fig.2　The effect of the liquid material rate on total flavonoids yield

2.2.2乙醇体积浓度对薄荷总黄酮提取率的影响由图3可知，乙醇体积分数30%～50%之间，随着乙醇体积分数增加，总黄酮提取率增加。由于薄荷中黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异。一般游离的黄酮苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中；黄酮类化合物在羟基糖苷化后，水溶性相应加大，在有机溶剂中溶解度则相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱液等强极性溶剂中［12］。薄荷中含有大量的黄酮苷类物质，使用较大极性的溶剂提取效果较好。50%乙醇体积分数溶剂总黄酮提取率达到最高，可能是50%乙醇溶剂既有利于以苷类形式存在的大部分黄酮类物质浸出，又有利于一些游离的黄酮类物质浸出［13］。之后随着乙醇体积分数增加，提取率减少，同时提取液颜色变化明显。这可能是乙醇体积分数过高，薄荷中色素、脂溶性物质、糖类及黏性物质等物质大量渗出［14］，影响总黄酮提取，同时破坏了总黄酮的稳定性。故本实验选择50%乙醇体积分数，作为响应面实验的中心点。

图3　乙醇浓度对薄荷总黄酮提取的影响Fig.3　The effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2.3水浴温度对薄荷总黄酮提取率的影响由图4可知，当水浴温度在40～60℃之间，随着温度升高，薄荷总黄酮提取率增大，可能是温度升高加快了分子热运动速度和提高了总黄酮渗透扩散溶解能力，加快物质的溶出，但杂质也易被提取出［15］。

水浴温度达到60℃以后，总黄酮提取率趋于稳定，总黄酮几乎完全浸出，溶剂达到饱和。当水浴温度超过70℃以后，总黄酮提取率逐渐降低，可能温度过高，总黄酮组织结构和稳定性被破坏，氧化分解，总黄酮含量降低。同时，温度过高，溶剂挥发，造成溶剂损失，影响薄荷总黄酮提取效果。本实验选择60℃水浴温度作为响应面实验的中心点。

图4　水浴温度对薄荷总黄酮提取的影响Fig.4　The effect of bath temperature on total flavonoids yield

2.2.4超声时间对薄荷总黄酮提取率的影响由图5可知，超声时间20～40min之间，随着时间增加，总黄酮提取率逐渐增加，主要由于超声波产生强烈的空化效应、机械振动、乳化、扩散、击碎和搅拌作用，击破植物细胞膜，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而增加了溶剂向细胞内扩散，加速薄荷中总黄酮进入溶剂。同时，超声波的热效应使水温基本在57℃左右，对原料起到了水浴加热的作用［16］。

图5　超声时间对薄荷总黄酮提取的影响Fig.5　The effect of ultrasonic treatment time on total flavonoids yield

超声波处理在开始段，时间与有效物质的提取率呈正相关，在达到一定时间后提取效果不再明显，由于随着时间增加，超声波对细胞膜破碎作用进一步加大，粘液等杂质相应增加，使浸提液粘度增大，扩散速度降低，影响总黄酮提取率［17］。当超声时间达到40min以后，总黄酮提取率有所降低，可能超声波处理时间过长，总黄酮被破坏，同时超声时间增加，温度也随之升高，总黄酮稳定性降低。随着超声时间的增加，一部分黄酮类化合物被超声波分解［18］，选择30、40、50min超声时间，进行响应面优化实验。

2.3薄荷总黄酮响应面实验分析

2.3.1多元二次模型方程的建立与检验薄荷总黄酮提取的响应面分析实验选取3个对提取效果影响较显著的因素：乙醇浓度（A）、水浴温度（B）和超声时间（C），根据Box-Beknhen中心组合实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验。实验设计了17组实验，其中包括5组中心点重复实验，每组实验平行重复三次，数据结果如表2所示。

表2　Box-Behnken实验设计及实验数据结果Table 2　Box-Behnken design matrix and the experimental result

利用Design Expert 8.0软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，得到薄荷总黄酮提取的回归方程为：Y=3.102+0.17125A+0.005B-0.08625C-0.18225A2-0.05975B2-0.05725C2+0.065AB+0.0225AC+0.105BC。

对响应面多元二次模型进行方差分析，分析结果如表3所示。从表3数据中可知，本实验所选用的二次多项模型p=0.0002＜0.01，说明该模型二次方程极显著，表明本实验方法是可靠的，该方程对模拟真实的三因素三水平的分析是可行的［19］。模型失拟项在α=0.05水平上不显著（p=0.8716＞0.05），说明未知因素对本实验的结果干扰小，其R2为0.9703说明该二次多项模型93.20%的响应值的变化能解释，有总变异的6.80%不能用该二次多项模型来解释，表明该模型的拟合度好，用此模型可以对薄荷总黄酮提取工艺进行优化。

表3　二次多项模型方差分析结果Table 3　Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

对该回归方程的回归系数进行显著性检验，其结果如表4所示。可知，一次项A（p＜0.01）和C（p＜0.01），二次项A2（p＜0.01）和C2（p＜0.01）均在1%的水平内显著（极显著），二次项B2（p＜0.05）在5%的水平内显著，表明在薄荷总黄酮提取工艺过程中，乙醇浓度和超声时间对总黄酮提取有极其显著的影响。交互项BC（p＜0.01）在1%的水平内显著（极显著），AB（p＜0.05）在5%的水平内显著，表明水浴温度和超声时间的交互作用对总黄酮的提取有极其显著的影响，乙醇浓度和水浴温度的交互作用对总黄酮的提取也有显著的影响。

表4　回归方程系数显著性检验结果Table 4　Regression coefficients and their significance of the quadratic model

图6　乙醇浓度与水浴温度交互作用影响总黄酮提取率的曲面图Fig.6　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus ethanol concentration and bath temperature

2.3.2响应面分析和优化通过响应面二次多项模型方程的建立，得出响应面的曲面图，如图6～图8所示。通过动态图可分析和评价任意两种因素的交互作用影响总黄酮提取率的效应，还可以从图中确定最佳因素的水平范围。等高线的形状反映出交互作用影响效应的强弱与大小，椭圆形表示两种因素的交互作用影响显著，而圆形则表示两种因素的交互作用影响不显著［20］。

由图6可以看出乙醇浓度与水浴温度对总黄酮提取率的交互作用的影响效应。从等高线图可知，乙醇浓度与水浴温度的交互作用影响显著。将超声时间固定在0水平时，总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而先增加后降低，当乙醇浓度达到55%时达最大值后开始降低。总黄酮提取率随着水浴温度的升高而增加，从图6中也可以乙醇浓度对提取率的曲线较为陡峭，说明在提取过程中乙醇浓度的对提取率的影响大于水浴温度。

图7 乙醇浓度与超声时间交互作用影响总黄酮提取率的曲面图Fig.7　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus ethanol concentration and ultrasonic treatment time

图7表示乙醇浓度与超声时间对薄荷总黄酮提取率的交互作用的影响效应。其等高线图表明乙醇浓度与超声时间的交互作用影响不显著。当把水浴温度固定在0水平，随着超声时间的增加，提取率呈现先增大后减小的趋势，在40min，总黄酮提取率达到最大点，随着时间增加，而略有降低，可能由于超声波对细胞膜破碎作用进一步加大，粘液等杂质相应增加，使浸提液粘度增大，扩散速度降低，影响总黄酮提取率。

图8　水浴温度与超声时间交互作用影响总黄酮提取率的曲面图Fig.8　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus bath temperature and ultrasonic treatment time

图8反映了水浴温度与超声时间对薄荷总黄酮提取率的交互作用的影响效应。从图8中的等高线图及曲面图可知，水浴温度与超声时间这两种因素对总黄酮提取率的交互作用影响十分显著。当乙醇浓度固定在0水平上，随着水浴温度的增大，总黄酮提取率呈增大趋势。随超声时间的增加，总黄酮提取率先增加后减小。水浴温度为60℃，超声时间为40min时，薄荷总黄酮提取率获得最大值。

2.3.3模型验证实验根据Box-Behnken实验得到的结果以及二次多项回归方程，并利用Design Expert 8.0软件，获得本实验薄荷总黄酮提取率最高时的各因素的最佳提取条件为乙醇体积分数50%、水浴温度50℃、超声时间30min。在此条件下，薄荷总黄酮提取率为3.17%。对此优化提取条件进行验证实验，重复进行三次，测得薄荷总黄酮提取率为3.06%、3.18%和3.09%，平均值为3.11%±0.06%，与理论计算值的误差在±1%以内，该模型能较好地预测实际的薄荷总黄酮提取情况。

3　结论

通过乙醇溶剂提取薄荷中总黄酮，辅助超声波提取，采用可见分光光度计法测定总黄酮含量，以乙醇浓度、液料比、水浴温度和超声提取时间为因素，通过单因素实验和响应面实验优化提取工艺，采用乙醇体积分数50%、料液比1∶20、水浴温度50℃和超声时间30min的条件，测得井冈山野生薄荷全草的总黄酮提取率在3.11%±0.06%，优化后得到的预测结果与实验结果较吻合。与同类研究相比，发现不同产地的薄荷总黄酮含量有很大的差异，不同采摘期薄荷中黄酮含量也不一样［21］。本研究为薄荷黄酮类化合物的利用提供理论依据，为提高薄荷的综合利用价值奠定基础。

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Optimization of extraction technology of total flavonoids from Mentha haplocalyx by response surface methodology

GAO Dan-dan，GUO Peng-hui，QI Gao-zhan，WEN Hai-chao
（College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China）

Ultrasonic-assisted method was used to extract the total flavonoids from Mentha haplocalyx，and the effects of ethanol concentration，ultrasonic treatment time，solid-liquid ratio and bath temperature on the extraction rate of total flavonoids were investigated.On the basis of single factor tests，the extraction technology of total flavonoids from Mentha haplocalyx was optimized by response surface methodology.The optimum conditions obtained were as follows：ethanol concentration was 50%，extraction time was 30min，solid-liquid ratio was 1∶20 and bath temperature was 50℃.Under this conditions，the extraction rate values of total flavonoids was 3.11%±0.06%.

Mentha haplocalyx；total flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306（2015）02-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.056

2014－05－21

高丹丹（1983-），女，博士研究生，副教授，研究方向：食品生物技术。

西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金（31920130047）。