葡萄枝条提取物的抑菌活性及其在红地球葡萄防腐保鲜上的应用研究

孙玉霞，蒋锡龙，史红梅，管雪强，王恒振（.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南5000；.山东省葡萄研究院，山东济南5000）

葡萄枝条提取物的抑菌活性及其在红地球葡萄防腐保鲜上的应用研究

孙玉霞1，蒋锡龙2，史红梅2，管雪强1，王恒振1
（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.山东省葡萄研究院，山东济南250100）

采用微量肉汤稀释法研究了葡萄枝条提取物对供试3种真菌和5种细菌的最小抑菌浓度（MIC），结果表明葡萄枝条提取物对真菌和细菌均有一定的抑菌活性；为进一步明确葡萄枝条提取物在葡萄防腐保鲜中的应用，以红地球葡萄为试材，分别以葡萄枝条提取物、壳聚糖及葡萄枝条提取物与壳聚糖复合溶液作为保鲜剂，研究了其对葡萄防腐保鲜的作用效果，结果表明葡萄枝条提取物与壳聚糖复合涂膜处理能够降低葡萄的失水率、保持可溶性固形物含量和含酸量等品质指标，同时对降低果皮上真菌和细菌菌落总数作用显著（p＜0.05）。

葡萄枝条，提取物，抑菌活性，保鲜

葡萄是世界上产量最大的水果之一，因其酸甜可口、营养和保健价值丰富而深受人们的喜爱。但是葡萄皮薄多汁，自然条件下保鲜期较短，为此国内外研究人员做了大量的工作以解决这一问题，如二氧化硫、二氧化氯、仲丁胺等保鲜剂的使用；以及臭氧处理、低温贮存和气调贮存等。由于常用的防腐保鲜剂的化学残留对人体健康和环境污染存在潜在风险，因此，来自植物自身的天然抑菌成分日益受到重视，如芦荟提取物［1］、丹皮酚及其白芷多糖包合物［2］、蒲公英绿原酸及其包合物［3］等，此外壳聚糖（chitosan，简称CTS）作为一种天然的聚合物糖类，由于能够有效地提高植物的抗病性或延长水果的保鲜期［4］也被广泛地应用于葡萄的保鲜研究中［5-6］。

葡萄枝条作为栽培过程中修剪下的废弃物，其中含有丰富的多酚类物质，作者已对葡萄枝条提取物的多酚含量、种类及抗氧化活性做过系统研究［7］，本研究继续对其抑菌活性及其在葡萄防腐保鲜上的应用进行相关实验，以红地球葡萄为试材，进行采后葡萄枝条提取物及其与壳聚糖的复合处理，通过对葡萄品质指标和果皮上真菌、细菌菌落总数的分析，研究其对葡萄保鲜防腐的作用效果，以期找到一种适用于葡萄防腐保鲜的新技术，延长葡萄的货架期。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄品种红地球，2012年8月采自平度市大泽山镇；壳聚糖购自济南海得贝海洋生物工程有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）均由山东大学微生物技术国家重点实验室提供；乳酸菌（Oenococcus oeni）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 法国Lallemand公司，将所有供试的菌种接入相对应的试管斜面培养基上，每种菌接三支重复，细菌置37℃恒温培养18～24h，霉菌、酵母培养28℃恒温培养44～48h；细菌平板培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，成分为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH7.2～7.6，121℃高压灭菌20min；真菌平板培养基孟加拉红培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品，成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯霉素0.1g/L，琼脂18.4g/L，孟加拉红0.033g/L，121℃高压灭菌20min。

YXQG02手提式电热压力蒸汽消毒器山东新华安得医疗用品有限公司；SW-CJ-ZD超净工作台苏州净化设备有限公司；WYT-32型手持糖量计泉州光学仪器厂；GSP-9160MBE型隔水式恒温静置培养箱上海博迅实业有限公司；HZQ-Q全温振荡器哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2实验方法

1.2.1葡萄枝条提取物制备修剪下的葡萄枝条经干燥粉碎后过40目筛，用50%乙醇水溶液60℃振荡提取1h，提取3次，合并滤液，5000r/min离心后50℃减压浓缩，再经大孔树脂纯化并真空干燥后得葡萄枝条提取物。

1.2.2防腐保鲜剂制备葡萄枝条提取物溶液：将葡萄枝条提取物用少量50%乙醇溶解后用蒸馏水稀释，配制成64mg/L（以没食子酸含量计，福林-肖卡法）溶液，记为G。

壳聚糖溶液：将壳聚糖用1%（V/V）的乙酸溶液溶解，再用1mol/L的NaOH调节pH至中性，配制成0.5%（W/V）的壳聚糖溶液，并搅拌均匀，记为C。

复合防腐保鲜剂：将葡萄枝条提取液用上述0.5%（W/V）的壳聚糖溶液稀释，配制成64mg/L溶液，记为GC。

1.2.3葡萄处理方法选择无腐烂霉变、成熟度和穗型较一致的新鲜葡萄，随机分成4组，每组5穗，在不同浓度的保鲜剂中浸泡2min，取出自然晾干，以不浸果为对照，室温下放置于塑料筐中。每个浓度的保鲜剂平行处理3组，每隔2d取样测定其可溶性固形物、含酸量、失水率等品质指标及真菌和细菌菌落数。

1.2.4测定方法MIC测定方法：采用微量肉汤稀释法［8］。培养基制备同常量肉汤稀释法，将倍比稀释后不同浓度的提取液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第7孔加液，每孔10μL，第8孔不加提取液作为生长对照。将菌悬液经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μL，密封后置35℃培养箱中，孵育24h判断结果。当对照孔内细菌明显生长，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低提取液物浓度为MIC。

可溶性固形物：以手持式糖量计测定折光糖度计。

含酸量：酸碱滴定法测定［9］。

失水率（%）：（初始果重-贮存后果重）/初始果重×100。

菌落数：从每组3个平行果穗上各剪下2个果粒，称重后，置于100mL无菌0.9%NaCl中，浸泡10min，每2min摇动1次，将果粒表皮菌落充分洗下。取1mL含菌水加入装有9mL无菌0.9%NaCl的试管中（此时稀释倍数为10-3），相同操作稀释至10-4倍。从10-3倍稀释液中取0.1mL加入细菌平板，从10-4倍释液中取0.1mL加入真菌平板（各做2个平行），涂布均匀。细菌37℃静置培养24h，真菌28℃静置培养72h，计数。

1.3数据处理

数据统计分析采用SPSS18.0软件，多组间比较用One-Way ANOVA法。

2　结果与讨论

2.1葡萄枝条提取液的MIC

葡萄枝条提取液对供试的5种细菌（枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳酸菌）和3种真菌（灰绿青霉、黑曲霉、酿酒酵母）均有明显的抑制作用，最低抑菌浓度见表1。该提取液对真菌的抑菌效果略好于对细菌的抑菌效果，对黑曲霉和酿酒酵母的MIC最低为16mg/L；其次为灰绿青霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和乳酸菌，均为32mg/L；对绿脓杆菌和大肠杆菌的MIC为64mg/L。但在李春丽等［10］对芒果核多酚抑菌活性的研究中，提取物对细菌的抑菌效果较好，而对真菌无明显抑制效果；郝少丽等［11］亦报道苹果渣多酚纯化物对细菌的抑制作用较强，而对供试霉菌、酵母菌抑制作用不明显，这可能是与提取物成分的差异有关。葡萄枝条提取物对真菌的抑制作用为其在果蔬防腐保鲜上的应用提供了理论依据，也据此选取64mg/L为保鲜实验的提取物含量。

表1　葡萄枝条提取液的MIC测定结果Table 1　MIC results of the extract from grape cane

2.2不同处理对葡萄贮存期间失水率的影响

由图1可知，与对照组相比，保鲜剂处理均可降低葡萄果实失水率。虽然在开始的第3d，各处理的失水率相差不大，可是随着储存时间的延长，葡萄枝条提取物与壳聚糖复合保鲜剂的效果越明显。在贮存时间到达15d后，用葡萄枝条提取物与壳聚糖复合处理的葡萄失水率为13.10%，而对照组的葡萄失水率已达14.23%。这是因为葡萄经处理后可在表面形成一层无色透明的薄膜，阻止了水分蒸发，从而降低呼吸作用和水分的消耗。

图1　不同处理对葡萄贮存期间失水率的影响Fig.1　Changes of the evaporate ratio in grape fruit during storage

2.3不同处理对葡萄可溶性固形物和含酸量的影响

葡萄中的可溶性固形物主要包括葡萄糖、果糖等，其含量是决定葡萄营养价值和口感的一个重要指标。葡萄的含酸量也是决定葡萄品质的一个重要指标，主要的有机酸包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸等。另一方面，葡萄中的有机酸为其代谢活动中的基本物质，因此贮存期间葡萄含酸量的变化是反映营养物质消耗程度的重要指标。

由图2和图3可见：在常温贮存期间，经过处理的葡萄和对照组葡萄的可溶性固形物含量和含酸量随时间的延长均逐渐升高。但经过保鲜剂处理的葡萄升高的速度明显降低，各处理的可溶性固形物含量和含酸量均明显低于对照，其中以葡萄枝条提取物和壳聚糖复合处理的葡萄的可溶性固形物含量和含酸量变化幅度最少，分别上升3.4%和0.67g/L；而未经保鲜剂处理的葡萄可溶性固形物上升4.8%、含酸量升高0.97g/L。这是因为经涂膜处理后的葡萄失水率降低，而且由于保鲜剂的作用降低了果实的呼吸消耗，使得葡萄因失水造成可溶性固形物含量和含酸量增加。

图2　不同处理葡萄储存期间可溶性固形物含量的变化Fig.2　Changes of the soluble solid contents in grape fruit during storage

图3　不同处理葡萄储存期间含酸量的变化Fig.3　Changes of the titratable acids in grape fruit during storage

2.4不同处理对葡萄贮存期间果皮表面真菌和细菌菌落数的影响

不同处理的葡萄储存3～15d表皮细菌和真菌菌落总数见图4和图5所示，经过保鲜剂处理的葡萄在储存期间的菌落总数均低于对照，但不同处理之间差异较大。贮存15d后，相比对照的细菌菌落总数11.89×104cfu/g，仅用葡萄枝条提取液处理的葡萄细菌菌落总数为9.76×104cfu/g；而经壳聚糖涂膜和葡萄枝条提取物与壳聚糖复合涂膜处理的细菌菌落总数分别为2.38×104cfu/g和1.51×104cfu/g，仅为对照的20.02%和12.70%。

图4　不同处理葡萄储存期间细菌菌落总数的变化Fig.4　Changes of the total number of bacterial colonies in grape fruit during storage

储存15d后未经处理的葡萄真菌菌落总数为15.22×105cfu/g，仅用葡萄枝条提取液处理的葡萄真菌菌落总数为7.78×105cfu/g；而经壳聚糖涂膜和葡萄枝条提取物与壳聚糖复合涂膜处理的真菌菌落总数分别为1.63×105cfu/g和0.92×105cfu/g，仅为对照10.71%和6.04%。由此可见，仅用葡萄枝条提取液作为保鲜剂，与对照相比虽然有一定的抑菌效果，但不如其与壳聚糖符合涂膜处理的抑菌效果显著（p＜0.05）。这是因为壳聚糖亦能有效地抑制细菌和真菌的生长和繁殖［12］，与同样具有抑菌作用的葡萄枝条提取液复合使用，可以达到更好的保鲜防腐效果。从图4和图5可以看出，贮存期间葡萄枝条提取液与壳聚糖复合涂膜处理比单一保鲜剂处理的抑菌效果显著提高（p＜0.05）。

图5　不同处理葡萄储存期间真菌菌落总数的变化Fig.5　Changes of the total number of fungal colonies in grape fruit during storage

3　结论

从MIC实验结果可知葡萄枝条提取物对真菌和细菌均有一定的抑制作用，但其葡萄防腐保鲜应用实验结果显示，该提取物对真菌的抑菌活性要好于其对细菌的抑菌活性。采用葡萄枝条提取物、壳聚糖、该提取物与壳聚糖复合涂膜均对葡萄常温储存具有一定的防腐保鲜作用，其中以葡萄枝条提取液与壳聚糖复合涂膜处理对葡萄储存期间的保鲜防腐效果最为显著（p＜0.05），优于单独使用葡萄枝条提取物、壳聚糖处理。使用该复合保鲜剂能较好地保持葡萄常温储存期间的果实品质，且作为天然的植物来源制剂，无毒无副作用，具有实际应用价值，并为农业废弃资源的综合利用提供了广阔的应用前景。

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Anti-microbial activity of grape cane extracts and its application on storage of Red Globe grape

SUN Yu-xia1，JIANG Xi-long2，SHI Hong-mei2，GUAN Xue-qiang1，WANG Heng-zhen1
（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan 250100，China；2.Shandong Grapevine Institute，Ji’nan 250100，China）

Micro broth dilution method was employed to investigate the minimal inhibitory concentration（MIC）of the grape cane extracts to 3 kinds of fungi and 5 kinds of bacteria.The results showed that the grape cane extracts had significant effect on inhibiting the activities of selected microorganisms.In order to acquire more information about the application of grape cane extracts on table grape storage，compared the preservative effect of three substrates，i.e.grape cane extracts，chitosan，and the mixture of above two substrates on table grape（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）.It was found that preservative films smearing with grape cane extracts and chitosan efficiently prevented the clusters from serious dehydration，helped sustain the soluble solid content and titratable acidity of berries，and significantly reduced（p＜0.05）the total plate count of fungi and bacteria on the berry surface.

grape cane；extract；anti-microbial activity；preservation

TS255.3

A

1002-0306（2015）02-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.020

2014－05－07

孙玉霞（1973-），女，硕士研究生，副研究员，研究方向：酿酒技术及风味物质研究。

山东省农业重大应用创新课题。