产酸优势醋酸菌的分离及其增殖产酸与乙醇的灰色关联分析

叶日英，伍　彬，陈海燕

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

产酸优势醋酸菌的分离及其增殖产酸与乙醇的灰色关联分析

叶日英，伍彬，陈海燕

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

为了从自然界中分离得到产酸能力较强的醋酸菌，并明确发酵基质中乙醇浓度对醋酸菌细胞增殖和产酸量的相关关系。实验以腐烂的菠萝果实为原料进行醋酸菌分离纯化，选取溶钙圈较大的菌落进行发酵产酸对比实验，经过对发酵液含酸量的测定，找出产酸量最大的菌株，然后将目标菌分别接种到不同乙醇浓度的发酵液进行恒温发酵，经过一定时间后检测各个发酵液的醋酸菌细胞总量和产酸量，所得数据用灰色关联分析法处理，通过计算获得醋酸菌细胞增殖和产酸量与乙醇浓度的关联度，并比较两者的关联序。实验结果获得一株产酸能力相对较强的醋酸菌S1，发酵液乙醇浓度与S1产酸量和细胞增殖的关联度分别是0.655、0.517。结果表明：乙醇对S1产酸量关联显著（关联度＞0.6），而对S1细胞增殖关联不显著（关联度＜0.6），乙醇对醋酸菌产酸的影响效果大于对其细胞增殖的影响。

醋酸菌，细胞增殖，产酸量，乙醇，灰色关联分析

醋酸菌是专性好氧细菌，能把乙醇氧化为醋酸，是食品工业上用于发酵生产醋酸的菌种。由于醋酸对人体具有重要的保键作用，如预防高血压、高血脂、脂肪肝和糖尿病［1］等等，所以醋酸一直受到人们的重视。很早以前人们主要把醋作为调味品食用，随着生活水平的提高，人们对醋的需求不再满足于纯粹的调味作用，更多地追求醋酸新产品，现在已经实现了大规模开发和生产醋酸饮料，其中最大宗的是水果发酵醋饮料如苹果醋饮料、红枣醋饮料和菠萝醋饮料等等，据不完全统计，目前我国食醋的年产量约为200～250万吨［2］。由于食醋是由醋酸菌发酵产生的，所以醋酸菌是生产食醋最关键的条件，目前我国用于食醋生产的醋酸菌主要是中科1.41及沪酿1.01菌株，均为醋酸杆菌属细菌。为了追求产醋酸能力较大、产醋酸口感质量更好的醋酸菌种，研究人员一直致力于探索和研究新的醋酸菌种［3-8］。醋酸菌在自然界的分布很广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒、果酒以及成熟或腐败的水果中都有醋酸菌生长［9-10］。为了得到口感质量较好，醋酸产量较大的醋酸发酵技术，研究人员从发酵温度、初始pH、发酵时间和基质成分等方面进行了许多研究［11］，相关的研究报道证明，发酵基质的乙醇浓度对醋酸菌的发酵产酸影响较大［12-13］，但对乙醇影响醋酸菌发酵的机理过程的目前未见有研究报道。因为醋酸菌发酵过程主要是不断地进行细胞增殖和产酸的过程，据此本项目实验用腐烂的菠萝果实分离醋酸菌，通过产酸对比实验寻找产酸能力相对较强的菌株，然后进一步对分离得到的菌株作不同乙醇浓度的培养发酵实验，检测醋酸菌在不同乙醇浓度中细胞的增殖量和产酸量，所得实验数据用灰色关联分析法（Grey Relational Analysis）处理［14］，通过计算细胞增殖量和产酸量与乙醇浓度的关联度和关联序，从而确定乙醇对醋酸菌细胞增殖和产酸量影响效果的大小。

灰色关联理论是通过一定的方法，寻求在一个系统发展中几个因素之间的数值变化关系，其意义是指在系统发展过程中，如果两个因素的同步变化程度越高，则其关联度就越大，反之关联度越小，灰色关联分析法可以为一个系统中几个因素的发展态势作出量化的比较。灰色关联分析法是进行科研实验数据处理和分析的较好方法，得到广大科研工作者的喜爱和应用，已经广泛应用于社会科学、微生物学和毒理学研究的数据统计分析［14-15］。由于醋酸菌的发酵过程是不断地进行细胞增殖和产酸的过程，因此，利用灰色关联分析法计算乙醇浓度分别与醋酸菌的细胞增殖和产酸量的灰色关联度，得到乙醇分别对醋酸菌的细胞增殖和产酸量影响程度的量化比较，就能明确乙醇对醋酸菌发酵效果影响的关键原因。

1　材料与方法

1.1材料与设备

腐烂菠萝取自湛江市徐闻菠萝种植园；分离用培养基葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇3%、琼脂2%、CaCO32%，自然pH；液态基础培养基葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇6%，pH 5.5；上述的试剂均购买于北京陆桥技术责任有限公司，为化学纯。

SW-CJ-2F型超净工作台苏州净化设备有限公司；HZQ-F160型恒温振荡培养箱金坛市万华实验仪器厂；L1100A型生物显微镜广州粤显光学仪器有限责任公司；2-16K型离心机Sigma公司；GZX-9140MBE型立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司。

1.2实验方法

1.2.1增菌培养及醋酸菌的分离取10g腐烂菠萝捣碎后加入盛有100m L液态基础培养基的三角瓶中，置于32℃恒温振荡培养箱中增殖培养3d后，吸取1m L加入装有9m L的无菌生理盐水的试管中，制成浓度梯度为10-1的菌悬液，然后逐步稀释至10-5、10-6、10-7浓度梯度，吸取后三个浓度梯度的稀释液各0.2m L，用倾注法接种于分离培养基，每个梯度2个平板，32℃恒温培养2～3d后观察。根据醋酸菌在分离培养基上是否产生溶钙圈初步定性［14］，若产生溶钙圈，则初步定为醋酸菌；从不同的稀释度的平板中挑取溶钙圈较大、长势良好的单菌落进行纯化［16-17］。

1.2.2产醋酸定性实验根据醋酸菌培养液与FeCl3溶液反应进行醋酸定性实验［17］。取活化好的斜面菌种一环，分别接种于100m L基础液态培养基中，30℃恒温培养箱静置浅层培养72h。利用离心机除去菌体，取5m L除去菌体的培养液于小烧杯中，用0.1mol/L NaOH溶液中和至中性，然后加入5～6滴5.0%的三氯化铁溶液，若形成红褐色沉淀则此菌株可鉴定为醋酸菌［19］。

1.2.3产酸优势菌株的确定将初筛得到的菌株接种于液态基础发酵培养基中，每株菌平行3组，于32℃恒温培养箱中培养4d后，利用醋酸定量测定法测定发酵液中的醋酸含量：精确吸取发酵液2m L至250m L三角瓶中，并加入蒸馏水50m L，滴加3～5滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。由消耗的NaOH溶液的体积计算样品中的含酸量（以醋酸计），确定产酸量大的醋酸菌［20-21］。

产酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×60/L

式中：V—为发酵液样品滴定消耗的NaOH溶液的体积m L；V0—以空白培养基为对照滴定消耗的NaOH溶液的体积m L；CNaOH—NaOH溶液的浓度（mol/L）；L—样品体积；60—为醋酸分子量。

1.2.4乙醇浓度对醋酸菌细胞增殖和产酸的影响选取产酸优势菌株进行不同乙醇浓度发酵实验：取醋酸菌3环，接入20m L生理盐水（20m L/250m L三角瓶）中充分振荡摇匀，以2%接种量接种于基础液态培养基32℃培养48h，然后将种子液以5%的接种量分别接种于具有不同酒精浓度的100m L液态培养基的三角瓶中，其中的酒精度分别为3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol，于32℃振荡培养箱中发酵培养6d后，将发酵液离心（10000r/m in，15m in）沉淀，把醋酸菌细胞和发酵液分离，取上清液测定含酸量，并称取沉淀出来湿菌体重量，每个乙醇浓度2个平行，考察酒精浓度对醋酸菌生长和产酸的影响。

1.2.5数据处理分析法将不同乙醇浓度发酵液所测得的醋酸菌细胞增殖和产酸量数据，根据灰色关联分析法原理，分别进行灰色关联分析计算。

2　结果与讨论

2.1分离得到的醋酸菌菌落和细胞形态

经过平板分离培养48h得到菌落如图1所示，菌落的颜色白色或略带微黄，半透明或不透明，个体非常小，表面光滑湿润，所产的醋酸使碳酸钙溶解形成明显的透明圈。将菌落作平板划线纯化分离培养后得到三株菌，分别命名为S1、S2、S3，菌落特征如图2所示，从划线培养的菌落可以看到醋酸菌产生的醋酸使平皿底部的碳酸钙溶解形成明显的透明区域；将三株菌镜检，观察到S1和S2细胞都是明显的杆状形，S1细胞呈链状排列，较粗大，S2呈对状排列，杆状较细小，S3细胞呈椭圆形（图3），用三株菌的发酵液作醋酸定性鉴定实验结果都有红褐色现象，确认所得到三株菌都产醋酸［22］。

图1　腐烂菠萝中分离的醋酸菌菌落Fig.1　The separated acetic bacteria colony of rot pineapple

图2　3株菌划线培养的醋酸菌菌落Fig.2　Three strains of acetic bacterias colony with lineation inoculate

图3　三株醋酸菌的镜检细胞形态图Fig.3　The cellularmorphologymicroscopic of three strains acetic bacterias

2.2醋酸菌产酸优势菌株确定

将分离得到的3株醋酸菌用液态基础培养基进行产酸实验，通过发酵液的醋酸含量检测，结果S1、S2、S3菌株的产酸量分别是22.23、8.15、13.70g/L，S1菌产酸量较大，因此选择S1菌进行乙醇浓度影响实验［23］。

2.3乙醇浓度对S1菌细胞繁殖和产酸量的影响

选取31℃为发酵温度，将基础发酵液改变乙醇浓度时S1菌发酵6d细胞生长总量及产酸量分别如表1所示。

表1　不同酒精浓度下S1发酵液的细胞湿重及产酸量Table 1　The cellwetweightand acid yield of S1 fermentationbroth on differentalcohol concentration

表1的结果说明S1菌耐酒精能力达到为9%（V/V），高于这个浓度时细胞生长繁殖受到抑制，同时产酸量也减少。酒精浓度为9%（V/V）时可获得最高的产酸量36.27g/L。

2.4乙醇浓度与S1菌细胞繁殖和产酸量的灰色关联分析

按照灰色关联分析理论，将醋酸菌的细胞增殖和产酸量与乙醇浓度、建立动态模型，动态分析的建模方法［15］如下：

以乙醇浓度为参考数列，产酸量和细胞湿重为比较数列，建立原始数列，参考数列记作（y0代表乙醇浓度参考数列；k是实验组别，k=1，2，3，…6）；比较数列记作（yi代表产酸量和细胞湿重两个比较数列，i= 1，2）按下列公式将原始数列的数据进行无量纲化处理，以消除数量单位和级别不同所带来的影响，得到式（1），公式中的和Si分别表示平均值和标准差。

计算每个时刻点的参考数列与比较数列差的绝对值，并找出最大的和最小的差绝对值，得到差的绝对值序列，记作△i（k）最大差△max=；最小差△min=mix

计算相关系数按式（2）计算，关联系数的意义是指在某个时刻子因素与母因素的相对差值，ρ是分辩系数，取值在0～1之间，通常取0.5。

计算灰色关联度：根据相关系数，按公式（3）利用算术平均法计算出灰色关联度，关联度越接近1，说明两因素关联度越大，当ρ=0.5时，关联度≥0.6，就表示关联性显著［24］。利用灰色关联分析模型，根据表1的数据，经过数值无量纲化法处理后得到数值如表2所示。

表2　不同乙醇浓度的细胞湿重及产酸量无量纲化表Table 2　The cellwetweightand acid yield on differentalcohol concentration with dimensionlessmethod

表3　乙醇浓度与细胞湿重和酸含量的关联数值表Table 3　The relevance between alcohol concentration and cellwetweightand acid yield

根据无量纲化表数据，用matlab编程计算得到关联系数和关联度如表3所示。

由表3中乙醇浓度影响醋酸菌细胞增殖和产酸量的灰色关联计算结果看出，发酵液乙醇浓度对细胞增殖的关联度为0.517（＜0.6），说明关联不显著，而对产酸量的关联度为0.655（＞0.6），说明关联显著。这个结果说明乙醇对醋酸菌产酸量的作用效应大于对细胞增殖作用效应。

3　结论

从腐烂菠萝中分离筛选得到一株产酸能力较强醋酸菌S1，S1在基础液态培养基中发酵能达到22.23g/L，耐乙醇浓度最高达9%（vol）；发酵基质的乙醇浓度与醋酸菌细胞增殖关联不显著，而与醋酸菌产酸量关联显著，因此，发酵基质的乙醇浓度对醋酸菌产酸量影响程度较大，对醋酸菌细胞增殖的影响作用较小。

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The separation of acetic bacteria advantage lies in acid production and the grey relationalanalysis on its proliferation and acid production w ith ethylalcohol

YE Ri-ying，WU Bin，CHEN Hai-yan
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

In order to get acetic bacterial strain which had advantage lays in acid p roduction from nature，c lear and definite the relationship between its acid p roduction，cell p roliferation and ethanol concentration of fermentation substrate.In the experiment acetic bac teria was separation and purification w ith rotten pineapp le，the bacterial colony which had bigger solub le calcium circ le was selected and put into fermentation for acid p roduction.Then the strain which had the highest acid p rodution was found out after determ ined acid content of fermentation b roth.It was put into the fermentation experiment on constant tem perature w ith a series of alcohol concentration.After a time the cell p roliferation and acid p roduction were detec ted.Datas of these was put into analysis based on the g rey relational analysis，by calculation two relevancies between alcohol concentration and acid p roduction and cell p roliferation were acquired.And their relational sequence was put into compare.As the result，a acetic bacterial strain S1 which had advantage lies in acid p roduction was got out，the relationaldegree between acid p roduction，cellp roliferation of S1 and alcohol concentration respectively was 0.670 and 0.517.The results showed that the correlation was outstanding between acid p roduction of S1 and alcohol concentration（relational degree＞0.6），and the correlation was non-significant between cell p roliferation and alcohol concentration（relational deg ree＜0.6）.The effect of ethyl alcohol for acid p roduction was greater than that for cellp roliferation.

acetic bacteria；cellp roliferation；acid p roduction；ethylalcohol；the g rey relationalanalysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.028

2014-05-08

叶日英（1965-），女，本科，研究方向：食品科学与工程。

广东省科技厅农业攻关项目（2010B020313004）；广东省湛江市科技局科技攻关项目（2012C3104001）。