气相色谱法分析电子烟烟液中主要生物碱含量

韩书磊， 陈 欢*， 刘 彤， 付亚宁

(国家烟草质量监督检验中心，河南郑州 450001)

图1 烟碱及微量生物碱的结构图

电子烟(Electrical Cigarette，E-cigarette)，又名电子烟碱传送系统(Electronic Nicotine Delivery Systems，ENDS)，它能够通过内置雾化器将烟弹中的烟液雾化并将雾化气输送至口腔和肺部，而雾化气中往往含有不同浓度水平的烟碱[1]。近年来，电子烟的销量在全球呈快速增长之势，但是对电子烟烟液的主要化学成分分析的相关研究很少[2 - 8]。生物碱主要包括烟碱和其他微量生物碱。而烟碱作为烟草致瘾的主要原因，是电子烟的主要有效成分，但实际研究发现，电子烟烟液烟碱实际浓度往往与商家所标注实际浓度有差别[9，10]。微量生物碱如：降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱、可替宁等，总含量约占总生物碱的5%以下，往往与烟碱同时存在于烟草提取物中[11,12]。烟碱及微量生物碱的结构见图1。目前，人们对电子烟烟液中的主要生物碱含量进行测定的研究还很少。2013年，Etter等利用高效液相色谱法测定了电子烟烟液中的生物碱含量，但没有进行方法验证[7]。

本文建立了电子烟烟液中主要生物碱含量的气相色谱(GC)分析方法，并对19种电子烟品牌共计51种型号电子烟烟液进行含量测定，为电子烟产品的化学成分测定提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

SCION 456-GC气相色谱仪(美国，Bruker Daltonic公司)，配氢火焰离子化检测器(FID)；AE163电子天平(瑞士，Mettler公司)；KQ-700DB超声波发生器(昆山声仪器厂)。10～100 mL容量瓶，0.5～25 mL移液管等玻璃仪器；自动加液器(20～500 μL)。

降烟碱，麦斯明，新烟碱，假木贼碱，可替宁(纯度>99.5%，美国Sigma-aldrich公司)；烟碱(纯度>99.5%，国家烟草质量监督检验中心制)；正十七碳烷(内标)，4,4′-二联吡啶(内标);甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)。

19种品牌电子烟共计51种型号电子烟烟液系网络购买，为处于网络销量前列的品牌及型号。

1.2 标准工作溶液的配制

内标储备溶液(20 mg/mL，0.4 mg/mL)：准确移取约2.0 g正十七碳烷和40 mg 4,4′-二联吡啶于100 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解定容；混合标准储备溶液(40 μg/mL，5 000 μg/mL)：分别准确称取10 mg降烟碱麦斯明，新烟碱，假木贼碱、可替宁和1.25 g烟碱于250 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解定容；混合标准工作溶液：分别准确吸取0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0，2.0 mL混合标准储备溶液于10 mL棕色容量瓶中，再分别准确加入100 μL内标储备溶液，以甲醇定容。

1.3 样品前处理

准确称取约100 mg电子烟烟液于5 mL容量瓶中，准确加入100 μL内标储备溶液，再加入4 mL甲醇，然后以80 W的功率超声5 min，冷却至室温后，以甲醇定容。再加入约200 mg无水MgSO4，用手振荡0.5 min后，静置，澄清后，取上清液经0.22 μm有机相滤膜过滤后进行GC分析。

1.4 仪器条件

色谱柱：HP-50+型毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；检测器温度：250 ℃；进样口温度：250 ℃；载气：氮气(纯度≥99.999%)，恒流流速：2.0 mL/min；进样量：1 μL，分流比：10∶1。升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的速率至260 ℃，保持6 min。

1.5 目标物含量的确定

样品中目标物含量以下式计算：

(1)

式中：Xi为电子烟烟液中目标化合物浓度，mg/mL；ci为提取液中目标化合物浓度，mg/mL；c0为空白实验中目标化合物浓度，mg/mL；V为提取液定容体积，单位为毫升(mL)；ρ为电子烟烟液密度，mg/mL；m为电子烟烟液质量，mg。以2次平行测定的平均值为最终测定结果，精确至0.01 mg/mL。

图2 混合标准工作溶液色谱图

2 结果与讨论

2.1 内标的选择

在气相色谱分析中，相对于外标法，内标法能有效消除进样量等操作条件带来的误差，测定的结果更为准确。内标法中选择合适的内标物是关键。由于电子烟烟液中烟碱和其他5种微量生物碱的含量差别比较大，所以为了更准确定量，拟采用双内标模式。正十七碳烷性能稳定，与烟碱保留时间相近，是测定烟草及卷烟烟气中烟碱含量标准方法的推荐内标化合物[13,14]，而4,4′-二联吡啶与待测微量生物碱结构类似，故分别选择正十七碳烷和4,4′-二联吡啶分别作为烟碱及微量生物碱的内标。实验结果发现，正十七碳烷和4,4′-二联吡啶在烟液烟弹中基本没有杂质干扰，且与其他6种生物碱分离良好。

2.2 色谱柱的选择

烟碱及微量生物碱是中等极性化合物，分别试验了低极性的DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，中等极性的InertCap for AQUATIC-2(60 m×0.25 mm×1.40 μm)及HP-50+(30 m×0.32 mm×0.5 μm)型毛细管色谱柱。结果发现，DB-5MS及HP-50+色谱柱所得色谱图峰形尖锐，分离效果良好，但HP-50+对降烟碱和麦斯明的分离效果略好于DB-5MS(分离度分别为1.16和1.02)，而待测物在InertCap for AQUATIC-2色谱柱上出峰时间较晚，分析时间长。综合考虑各因素，选用HP-50+色谱柱作为分离柱，整个分析过程在20 min内完成，且降烟碱和麦斯明得到很好的分离。图2为HP-50+色谱柱条件下混合标准工作溶液的色谱图。

2.3 工作曲线和检出限

采用内标法进行定量，以各目标化合物的浓度(X,mg/mL)为横坐标，分析物与内标物的峰面积比(Y)为纵坐标建立标准曲线。结果表明：主要生物碱在各自的浓度范围内线性关系良好(R2均高于0.996)，以信噪比(S/N)≥3确定方法的检出限为0.00037%～0.0011%，可以满足定量分析的要求。主要生物碱的回归方程，相关系数及检出限如表1所示。

表1 电子烟烟液中主要生物碱的工作曲线及检出限

2.4 回收率和精密度

取已知含量的电子烟烟弹样品3份，分别按照低、中、高3种水平加入所测生物碱，每个添加水平重复测定6个样品，实验结果见表2。由表2可知，烟碱，麦斯明，假木贼碱，新烟碱及可替宁的平均加标回收率在97.1%～104.6%之间，平均相对标准偏差(RSD)小于4%。

表2 电子烟烟液中主要生物碱的平均加标回收率和平均相对标准偏差

需要说明的是，降烟碱在进行添加回收率实验时，回收率很低(小于10%)，而且后续实际样品分析也发现，绝大多数电子烟烟液中降烟碱皆未检出，这与文献报道烟草和烟草提取物中降烟碱含量明显不符[11,12]，推测可能是由于降烟碱在烟液中发生了降解或反应生成其他物质。

2.5 实际样品测试

采用本方法测定19种品牌电子烟共计51种型号电子烟烟液中的主要成分含量，典型色谱图如图3所示。

图3 典型样品溶液色谱图

2.5.1烟碱电子烟烟液中烟碱含量及其与生产厂商所标注烟碱浓度差异率如表3所示。可知：(1)不同电子烟烟液中烟碱含量差异较大，含量范围在0～28.36 mg/mL；(2)在烟碱标注含量为0的三种烟液中(30，42和49号)，有两种有烟碱检出(30和42号，含量分别为0.13和0.35 mg/mL)；(3)各生产商家所标注的低，中，高三种浓度水平，不同品牌每个水平的差别较大，如“低”水平的浓度范围为2.92～11.81 mg/mL，“中”水平的浓度范围为4.17～15.05%，“高”水平的浓度范围为11.52～28.36%；(4)在标注烟碱具体浓度的28种电子烟型号中，实测烟碱浓度与生产厂商所标注烟碱浓度差异率为-136.56%～100.00%，其中差异率绝对值在20%以内有21种，占75.0%，差异率绝对值大于20%的有7种，占25.0%。这表明电子烟烟液实际烟碱浓度和生产厂商标注浓度有所不符，这和美国食品药品监督管理局(FDA)的市场抽查结果一致[14]。

表3 电子烟烟液烟碱含量(mg/mL)

a:NA:means the content was not available;b:means unknown;c:Deviation percentage=(determined nicotine content-labelled nicotine content)/(determined nicotine content).

2.5.2微量生物碱实验结果表明，电子烟烟液中所测定总微量生物碱含量范围在0～0.045 mg/mL，所测定总微量生物碱含量与烟碱含量之比在0～3.50%，绝大多数在0.25%～2.00%，这与烟草及烟草制品中微量生物碱与烟碱含量比类似，也从侧面说明了电子烟烟液中烟草提取物的广泛使用。值得注意的是，部分电子烟品牌中微量生物碱含量与烟碱含量比低于0.2%，这说明这些电子烟烟液中烟碱的添加方式可能是烟碱纯品，而不是烟草提取物；绝大多数电子烟烟液都不含有降烟碱，而且降烟碱的加标回收率极低，这与文献报道烟草和烟草提取物中降烟碱含量明显不符[15,16]。这进一步说明，电子烟烟液在生产和存放过程中，其中个别成分可能会发生变化，包括生物碱。例如，烟碱在存放过程中容易被其他物质如香草，薄荷等香味物质氧化等[7]，这也对电子烟产品的原料采购，生产，贮藏，运输等环节提出更高的要求。

3 结论

建立了电子烟烟液中主要生物碱的气相色谱分析方法，该方法前处理简单有效，回收率好，灵敏度高，适合电子烟烟液中主要生物碱含量的快速准确测定，为电子烟产品的化学成分测定提供了技术支持。样品分析结果表明，绝大多数电子烟烟液含有烟碱及微量生物碱，不同烟液中烟碱含量差异较大，但与生产厂商所标注有不符之处，电子烟烟液中微量生物碱的广泛存在说明烟碱的主要来源为烟草提取。