固相萃取-加压毛细管电色谱法测定水体中8种农药残留

山 梅， 李 静,2， 茹 鑫,2， 郑 署， 王晓曦， 闫 超*

(1.上海交通大学药学院，上海 200240；2.上海通微分析技术有限公司，上海 201203)

农药是农业上防止病虫害的重要物质，但农药在使用后容易经雨水冲淋或农用灌溉水，经地面径流等途径进入地表水、地下水和土壤并造成污染[1]。因此，快速分离分析水中农药残留对水环境的监测有着深远的意义。水中农药的测定常采用气相色谱法，可是大部分农药具有很强的极性和热不稳定性，给气相色谱分析带来一定的难度[2]。高效液相色谱法虽然可靠性高、检测速度快，但其柱效没有气相色谱高，因此在分离复杂组分时很难达到满意的结果，另外由于使用了大量有机溶剂，也可对环境造成一定的污染。

加压毛细管电色谱(Pressurized Capillary Electrochromatography,pCEC)是近年发展起来的一种新型微分离分析技术。该技术结合了高效液相色谱(HPLC)与毛细管电泳(CE)的优点，通过在填充有HPLC填料的毛细管电色谱柱两端施加高压直流电场，以电渗流作为流动相的推动力，根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异，以及在电场中迁移速率的不同而实现分离[3]。pCEC采用电渗流和压力流同时驱动流动相，其电渗流部分使流动相流形呈柱塞状，因而减少了峰展宽，其理论塔板数高于HPLC[4]。pCEC不受柱内反压的限制，可使用粒度更小的填料与更长的毛细管柱，因此具有更高的分辨率。由于引入了HPLC固定相，和CE相比pCEC具备更好的选择性，使它不仅能分离带电物质，也能分离中性化合物，还可以通过改变泵压和分离电压来调节样品中各组分的保留，提高分离度。此外，在加电压的同时附加一定的压力驱动流动相，既可避免分离过程中气泡的产生，提高稳定性，又可用压力来控制流速，缩短分析时间，实现梯度洗脱[5]。pCEC具有高柱效、高选择性、高分离度、快速分离的特点。已有多篇文献报道pCEC在农药分离分析中的应用[6]。Wu等[7]采用加压毛细管电色谱-间接安培法测定了蔬菜和水果中6种有机磷农药；Ye等[8]采用加压毛细管电色谱法-紫外检测法分离分析卷心菜中6种拟除虫菊酯类农药残留。此外，pCEC还在核苷类药物[9]、手性药物分离[10]、中药分析[11]、生物技术[12]、代谢组学[13,14]等领域得到了广泛应用。

本文采用C18毛细管电色谱柱，基于加压毛细管电色谱-紫外(pCEC-UV)检测方法，建立了同时测定水体中乐果、敌敌畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基对硫磷、马拉硫磷、百菌清8种农药残留的分析方法。实验考察了等度洗脱条件下，流动相乙腈配比，缓冲溶液浓度、酸度及分离电压对目标化合物分离的影响，并对该方法进行了检出限、定量限、线性范围、回收率和精密度等方法学验证，结合固相萃取富集技术，可对水中多农药残留进行检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

TrisepTM-2100型加压毛细管电色谱仪(上海通微分析技术有限公司)，含二元溶剂高压输液泵、高压电源(±30 kV)、微流控装置、紫外-可见光检测器(190～600 nm ) 和色谱工作站；KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PB-10型pH计(北京赛多利斯仪器有限公司)；FA1004型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；CEC18固相萃取柱(500 mg/10mL,clean-up®)。

农药标准品：乐果、敌敌畏、克百威、莠去津、甲基对硫磷、马拉硫磷、百菌清(上海农药研究所)，甲萘威(上海江莱生物科技有限公司)；乙腈(色谱纯，TEDIA)，甲醇(色谱纯，SCRC)，乙酸乙酯(分析纯，SCRC)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)(优级纯，SCRC)，HCl(分析纯，SCRC)。实验用水为超纯水。

1.2 标准储备溶液的配制

分别准确称取乐果、敌敌畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基对硫磷、马拉硫磷、百菌清标准品0.1 g(精密至0.1 mg)，分别用甲醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀，即制备得1.0 mg/mL的农药标准储备溶液，于4 ℃冰箱避光保存，备用。

1.3 色谱条件

色谱柱：EP-100-20/45-1.8-C18柱(苏州环球色谱有限公司)，柱长45 cm(有效长度20 cm)；流动相：乙腈∶Tris-HCl 缓冲溶液(5 mmol/L，pH=7.1)=66∶34(V/V)；检测波长：220 nm；柱压：11.6 MPa；泵流速：0.06 mL/min；电压：-9 kV(色谱柱末端)；柱温：室温；进样体积：2 nL;分流比1∶450。

1.4 水样富集

水样采用CEC18固相萃取柱富集。先安装好真空抽滤装置及固相萃取装置，依次用乙酸乙酯、甲醇、超纯水各5 mL，分2次清洗固相萃取柱[15]，每次加液后保持5 min，再用真空泵抽取液体，使液体从萃取柱中呈滴状滴出，甲醇、蒸馏水的清洗方式同上。处理完后小柱处于活化状态。

用0.22 μm水系滤膜过滤自来水水样两次，再在水样中分别添加低、中、高不同浓度的标样[16]，均配制成加标混合液1 L，调节好分流阀和真空度(真空度小于20毫米汞柱)，使水样过柱的流速恒定在 8 mL/min。富集完毕后，将水抽干，氮气干燥3 min。用5 mL乙酸乙酯浸泡固相萃取柱1 min后淋洗，将洗脱液用氮吹仪吹至近干，加甲醇定容至1 mL。每个样品重复测定3次。

2 结果与讨论

2.1 加压毛细管电色谱分离条件的优化

2.1.1检测波长的选择除甲基对硫磷(280 nm)外，其它7种农药的吸收波长均在220 nm左右[17]。当波长设置为220 nm时，结果表明甲基对硫磷有吸收值，且吸收值较大，故选择220 nm作为测定波长。

2.1.2流动相种类和比例的优化相对于甲醇而言，选择乙腈作为pCEC的流动相时，由于其具有高电渗流和低粘度双重优点，可有效缩短分析时间，故选择乙腈为流动相。随着流动相中乙腈所占比例从60%升至70%，各物质的保留时间也随着减小，这主要是由于增加乙腈在流动相中所占的体积分数，使得电渗流增大，从而缩短了分析时间；同时随着乙腈比例的增加，各组分之间的分离度随之下降，当乙腈在流动相中的比例为66%时，峰形均较好，各组分达到基线分离。

2.1.4缓冲溶液pH值的选择8种农药在中性或弱酸性溶液中稳定，碱性溶液中易水解。实验比较了pH=5～6的Tris-HCl溶液与pH=7的Tris-HCl缓冲溶液。用pH=5～6的缓冲溶液的出峰时间比pH=7的缓冲溶液延后，故选用pH=7的缓冲体系。

2.1.5施加电压的选择分离电压是pCEC分离的主要动力之一，施加不同的电压对样品的分离能力和分离速度会产生影响。本实验中，8种农药的分离情况良好，因此实验仅考察pCEC施加电压对样品分离速度的影响。在优化条件下，考察了施加电压分别为0 kV、-3 kV、-6 kV和-9 kV时，8种农药的分离情况。如图1所示，随着电压的提高，pCEC具备的双重推动力使得8种农药的分离速度明显加快；当施加电压为-9 kV时，8种农药的分离时间由26 min左右缩短至16 min左右，保留时间缩短38%。如图2所示，各组分的柱效随施加电压的升高而增加，当施加电压为-12 kV时，各峰的吸收值、分离度和柱效均下降，且整体基线漂移。这是由于电压增大，毛细管色谱柱内焦耳热效应加剧，导致分离柱效率降低。综合考虑分离电压对分离速度和柱效率的影响，本实验确定最佳施加电压为-9 kV。

图1 施加电压对分离速度的影响

图2 施加不同电压时各组分的柱效

2.2 方法学验证

2.2.1线性范围及检出限在最优条件下，配制一系列不同浓度的8种农药混合标准溶液，进行加压毛细管电色谱分析，并绘制校准曲线。取最低浓度的标准品混合液(含乐果3.4 μg/mL；敌敌畏8.1 μg/mL；克百威1.2 μg/mL；甲萘威0.2 μg/mL；莠去津0.1 μg/mL；甲基对硫磷3.7 μg/mL；马拉硫磷11.2 μg/mL；百菌清2.1 μg/mL)，连续进样6次，考察色谱保留时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)。结果表明保留时间的RSD在0.38%～0.83%之间，峰面积的RSD在1.71%～1.91%之间，精密度良好。以信噪比(S/N)=10计算定量限(LOQ)，以S/N=3计算检出限(LOD)，所得结果见表1。

表1 8种农药的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检出限

2.2.2加标回收实验在自来水水样中分别添加低、中、高3种不同浓度的标准品溶液，按1.4中所述的方法进行加标回收率实验，结果见表2。可见，8种农药的加标回收率在71.0%～114.1%之间，RSD为1.1%～9.8%。未添加标准品的自来水水样空白溶液和添加标准品的自来水水样溶液经富集后检测到的色谱图如图3所示。由图3可见，通过样品前处理，自来水中基底并不干扰农药残留的检测，结合固相萃取技术，pCEC适合于我国环境水样中农药残留的分析检测的要求[21,22]。

表2 自来水中8种农药的加标回收率及相对标准偏差(n=3)

图3 自来水加标溶液(a)和自来水空白溶液(b)经富集后的色谱图

2.3 实际样品的分析

按照上述实验方法，分别测定了西湖水和自来水水样，均未检测出8种目标农药。这可能是因为采集水样时为多雨季节，致使西湖水和自来水水样中农药残留浓度均较低而未能检测到目标物。实验表明在有基体存在的条件下，使用该方法处理水样仍能得到较好的结果。

3 结论

实验以加压毛细管电色谱法为平台，在16 min内同时测定水样中乐果、敌敌畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基对硫磷、马拉硫磷、百菌清8种农药残留。采用乙腈∶Tris-HCl缓冲溶液为流动相，加压-9 kV，220 nm检测，8种农药的检出限在0.03～3.7 μg/mL之间，回收率在71.0%～114.1%之间，RSD在1.1%～9.8%之间。pCEC具有高柱效、高分辨率、高分离度的特点，方法简单方便，准确可靠，适合于水样中多种农药残留的分析检测。