毛蚶提取物对环磷酰胺增效减毒作用的研究

冯巧巧，刘军田，马玉奎

(1. 山东省食品药品监督管理局审评认证中心，山东 济南 250013; 2. 山东省药学科学院，山东 济南 250100)

1 引 言

毛蚶(Arca Subcrenata Lischke)最早记载于《神农本草经》，俗称毛蛤、麻蛤， 属软体动物门、双壳纲、列齿目、蚶科，主要分布于中国、朝鲜和日本沿海[1]。毛蚶的营养与药用价值较高，其壳和肉皆有药用价值。毛蚶提取物是由毛蚶肉经低温提取纯化加工制成，其主要药效成分为毛蚶多糖、毛蚶多肽和毛蚶核酸，具有“温中健胃、益气补血、破结消痰”之功。本研究采用腹水型S180小鼠和免疫低下小鼠模型，初步考察了毛蚶提取物对环磷酰胺的增效减毒以及对免疫低下小鼠的非特异性免疫能力的作用。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1动物 昆明种小鼠(SCXK(京)2007-0001)，雌雄兼用，体重18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2.1.2药品与试剂 毛蚶提取物(山东省中医药研究院提供，批号100805)；注射用环磷酰胺(CTX，山西仟源制药有限公司提供，批号：1011355)；印度墨汁(北京笃信精细制剂厂提供，批号：0101102)。

2.1.3仪器 Sysmex XT-2000IV型全自动血球计数仪(Sysmex Corporation)；MC00000539型721分光光度计(上海申化仪表自控公司)；Victor 1420多标记检测仪(美国PerkinElmer公司)；JY2001型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

2.2 方法

2.2.1对环磷酰胺的增效减毒作用[2]抽取腹水型S180小鼠种瘤后6 d内的腹水，以生理盐水稀释后调整细胞数为2.0×107～3.0×107个/ml，分别接种于小鼠右侧腋部皮下，每只0.2 ml。将接种后的小鼠随机分为以下8个试验组：分别为阴性对照组、单用CTX组、CTX+毛蚶提取物400 mg·kg-1、CTX+毛蚶提取物200 mg·kg-1、CTX+毛蚶提取物100 mg·kg-13个剂量组和单用毛蚶提取物400、200、100 mg·kg-13个剂量组。于接种次日给药，毛蚶提取物灌胃给药，给药容积为20 ml·kg-1，阴性对照组给予等容积蒸馏水。给予毛蚶提取物第9 d，除阴性对照组和单用毛蚶提取物组外，其余各鼠均静脉注射CTX 50 mg/kg，连续3 d。末次给予毛蚶提取物1 h后，除单用毛蚶提取物组外，其余所有动物眶静脉采血，于全自动血球计数仪测血白细胞(WBC)和血小板(PLT)数量。所有动物处死后解剖瘤块称瘤重、体重，计算抑瘤率。

肿瘤抑制率=(C-T)/C×100%，T为给药组平均瘤重，C为阴性对照组平均瘤重。得出抑瘤率后，以q值评定两药合用的疗效。

q值=E(AB)/[EA+(1-EA) ×EB]，E(AB)为两药合用的抑制率，EA 、EB为两药单用的抑制率，q=0.85～1.15表示两药作用相加，q>1.15表示两药作用协同，q<0.85表示两药作用拮抗。

2.2.2毛蚶提取物对小鼠巨细胞吞噬功能的影响[3]取体重18～22 g的昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组：正常对照组、模型组、毛蚶提取物400、200、100 mg·kg-13个剂量组，每组10只。各组分别灌胃给予不同浓度的药物，给药容积为20 ml·kg-1，正常对照和模型组给予等容积蒸馏水，每天给药1次，连续14 d。 于给药第7、9和11 d除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射CTX 50 mg/kg造模。末次给药后1 h，以0.2 mL/20g体重尾静脉注射25%(v/v)印度墨汁。分别于注射墨汁后2、10 min从眶静脉丛取血20 μL，加入到2 ml 0.1% Na2CO3溶液中，680 nm波长测其光密度(OD值)，解剖动物取肝脏、脾脏称重，计算廓清指数。

计算公式：廓清指数K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)，计算廓清指数(K)及校正廓清指数(α)。校正廓清指数α=K1/3×体重/(肝重+脾重) 。K：直线斜率，可表示吞噬速率；α：反映每单位组织重量的吞噬活性。

2.2.3毛蚶提取物对小鼠血清溶血素水平的影响[3]取体重18～22 g的昆明种小鼠60只，分组与给药剂量同2.2.2。给药5次后，除正常对照组外，其余各组腹腔注射20%兔红细胞生理盐水0.2 ml进行免疫，免疫后继续给药8 d。免疫后第2、4、6 d除正常对照组外，其余小鼠腹腔注射CTX 30 mg/kg造模。于末次给药1 h后，眶静脉采血制备血清，处死小鼠后取脾脏及胸腺称重，计算其指数。脏器指数=[脏器重量(g)/小鼠体重(g)]×100。将小鼠血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1 ml，与20%兔红细胞悬液0.5 ml、10%补体0.5 ml混匀，置37℃水浴中保温30 min，0℃终止反应，离心后取上清，于Victor 1420多标记检测仪540 nm处测OD值。

3 结果

3.1 毛蚶提取物对环磷酰胺的增效作用

与阴性对照组比较，环磷酰胺和毛蚶提取物合用后对肿瘤的抑制率明显高于单用环磷酰胺或者单用毛蚶提取物，其中环磷酰胺和毛蚶提取物200、400 mg·kg-1合用后q值大于0.85，具有明显的协同作用，说明毛蚶提取物在200 mg·kg-1剂量以上对环磷酰胺抗肿瘤作用具有明显的增强效果。见表1。

3.2 毛蚶提取物对环磷酰胺的减毒作用

与阴性对照组比较，环磷酰胺可明显减少模型小鼠的白细胞数量，而与毛蚶提取物合用后，白细胞数量与单用环磷酰胺比较明显升高，400和200 mg·kg-1剂量组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，各个剂量组对血小板数量无明显影响。见表2。

表1 毛蚶提取物对环磷酰胺抑瘤率的增效作用

注：*P<0.05, **P<0.01, vs模型组

表2 毛蚶提取物对环磷酰胺的减毒作用

注：*P<0.05, **P0.01, vs模型组

3.3 毛蚶提取物对小鼠巨细胞吞噬功能的影响

模型组与正常对照组比较，吞噬指数和校正廓清指数明显降低(P<0.05或P<0.01)，说明造模成功。毛蚶提取物200、400 mg·kg-1剂量组碳粒廓清指数和校正廓清指数与模型组比较明显提高(P<0.05)，提示毛蚶提取物200 mg·kg-1以上剂量可明显提高免疫低下小鼠单核吞噬细胞的吞噬功能。结果见表3。

3.4 毛蚶提取物对小鼠溶血素水平的影响

小鼠腹腔注射环磷酰胺后，胸腺和脾脏指数均明显低于正常对照组(P<0.05)，显示动物呈免疫抑制状态，证明造模成功。毛蚶提取物200、400 mg·kg-1剂量组OD值、胸腺和脾脏指数均明显高于模型组(P<0.05)，说明毛蚶提取物200 mg·kg-1以上剂量可明显提高免疫低下小鼠的免疫功能。见表4。

表3 毛蚶提取物对免疫低下小鼠碳廓清速率的影响

注：#P﹤0.05, # #P<0.01, vs正常对照组；*P<0.05, vs模型组

表4 海生素对小鼠溶血素水平、胸腺和脾脏系数的影响

#P<0.05, # #P<0.01, vs正常对照组；*P<0.05, vs模型组

4 讨论

恶性肿瘤是全球最大的公共卫生问题之一，全球每年新增癌症患者1 500多万人，随着我国工业化、城镇化和人口老龄化进程的加快，不良生活方式和环境污染等问题，我国癌症发病人数和死亡人数呈逐年上升趋势，恶性肿瘤的防治形势越来越严峻[4]。目前治疗肿瘤的主要方法是手术、放化疗以及生物免疫治疗等，其中化疗是西医最常见的治疗方法，但是目前临床上所有的化疗药物安全治疗窗比较小，治疗肿瘤的同时会带来严重的不良反应，且很容易出现耐药性，长期用药患者耐受性差，治疗效果不理想。如何提高化疗药物的治疗效果，降低不良反应是临床上亟待解决的问题，而中医药在这方面发挥了良好的作用。一般中药单用抗肿瘤效果较差，但可通过扶正培本和调节机体免疫功能等起到辅助抗肿瘤作用。

多种海洋生物均具有抗肿瘤活性，其中海洋贝类是目前开发研究的热点，毛蚶多糖和毛蚶多肽是毛蚶提取物中的主要生物活性成分，具有降血糖、降血脂、护肝、抗氧化、抗菌、免疫调节、抗肿瘤等作用[5-7]。本研究采用腹水型S180小鼠和免疫低下小鼠模型为实验对象，以其抑瘤率、白细胞、巨细胞吞噬功能、溶血素水平和胸腺、脾脏指数为指标，初步评价了毛蚶提取物对环磷酰胺的增效减毒作用以及对免疫功能的影响。研究结果显示，毛蚶提取物与环磷酰胺合用后可明显提高环磷酰胺对S180肉瘤的抑制效果，具有明显的增效作用，同时合用后模型小鼠白细胞减少程度显著降低，具有明显的减毒作用。免疫学初步试验结果提示，毛蚶提取物可明显提高环磷酰胺免疫低下小鼠的非特异性免疫能力，说明毛蚶提取物对环磷酰胺的增效减毒作用与其免疫调节能力有关。