乙型肝炎肝衰竭患者血清细胞因子与肝功能指标的关系

白洁　王晓霞

乙型肝炎肝衰竭患者血清细胞因子与肝功能指标的关系

白洁王晓霞

目的探讨患有慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF）的患者体内辅助性T细胞1/2（Th1/Th2）所分泌的细胞因子的含量，并探讨其含量变化在ACHBLF中的作用。方法 收集17例本院体检中心健康志愿者，35例患有ACHBLF以及18例患有慢性乙型肝炎（CHB）的患者的血清，利用流式细胞微球芯片捕获技术（CBA）检测血清中肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素4（IL4）、γ干扰素（IFNγ）、白细胞介素10（IL10）、白介素2（IL2）以及白介素6（IL6）的含量，并且分析ACHBLF患者血清内Th1/Th2细胞因子的变化情况。结果 健康对照组以及CHB组外周血循环中的IFNγ、IL4、TNFα以及IL6较ACHBLF显著降低（P=0.016、0.020、0.017、0.018）。IL2和IL10在健康组和CHB组中的含量与ACHBLF患者中的含量相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。ACHBLF患者血清中的凝血酶原活动度（PTA）、总胆红素（TBil）以及白蛋白（Alb）的含量与IFNγ、IL4、IL6以及TNFα的含量之间没有显著的相关性（P＞0.05）。结论 可能ACHBLF患者病情发展与血清中的细胞因子IL6、IFNγ、IL 4以及TNFα有一定的相关性，没有发现肝功能与上述细胞因子之间的相关关系。CBA可以应用于对各种细胞因子的检测。

慢加急性乙型肝炎肝衰竭；流式细胞微球芯片捕获技术；细胞因子

慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF），即由慢性乙型肝炎（CHB）发展而成的急性肝衰竭，属于重型慢性乙型肝炎。ACHBLF的病死率高达70％，是慢性重型肝炎中比较常见的一种疾病，通常起病急，预后差。ACHBLF的具体发病机制目前尚未阐明，但是相当复杂，很多的ACHBLF患者都是由于感染病毒，病毒在机体内活动活跃，使机体的免疫力下降，继而产生大面积的炎症反应，进而导致病情加重。在机体免疫应答中发挥重要作用的辅助性T细胞（Th），通过诱导其它重要的免疫细胞的活化而在机体中发挥重要的作用。Th细胞可以分为两个亚群，Th1和Th2亚群，这两个亚群的细胞在正常情况下处于一定的平衡状态，Th1、Th2分泌的细胞因子相互抑制，使彼此都不会大幅度的升高或者降低。但是在病理情况下Th1、Th2常失衡。近年来，有研究发现，肝细胞免疫损伤与乙型肝炎病毒（HBV）的持续性感染以及Th1、Th2的失衡有关。但目前对Th1、Th2产生的细胞因子的研究多采用酶联免疫吸附实验（ELISA），该方法样本需求量很大，每次又只能检测一种因子，无法真实地反映各种细胞因子之间的联系。现代化的研究需要一种更加高效，低用量的方法来对细胞因子进行检测。流式细胞微球芯片捕获术（cytometric beadar ray，CBA）高通量、精确性高，最大的优点是可以同时检测很多种细胞因子。本研究通过运用CBA检测患者Th1，Th2分泌的细胞因子的含量来探究患有ACHBLF患者的肝功能指标与细胞因子变化的联系。

资料和方法

一、临床资料

收集2014年1月到12月本院患有ACHBLF的患者35例，女6例，男29例。CHB患者18例，女8例，男10例。另外收集本院体检中心的17名健康志愿者作为对照组，女7名，男10名。患者入院3 d后清晨空腹取静脉血，检测其HBV DNA，血液学，HBV血清学标志物以及肝功能等相关指标。排除标准为药物性肝病，病毒感染，自身免疫性疾病，酒精性肝病，原发性肝癌、恶性肿瘤以及合并甲、丙、戊型肝炎病毒感染。所有参与研究的志愿者以及患者，须确保在3个月内没有使用过免疫调节药物。

二、研究方法

将Th1/Th2细胞因子的标准品溶解在2.0 m L稀释液中，在室温静置15 min以后稀释。稀释方法：取300μL的稀释液加入300μL的标准液，混匀，此时就是进行了1∶2稀释。使用倍比稀释依次进行1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256以及1∶512的倍数进行稀释。将6种捕获了细胞因子的磁珠等体积混匀，取50μL于分析管里。依次加入50μL标准品、50μL血清样本以及50μL藻红蛋白，混匀以后避光室温放置3 h。再加入1 m L的洗液，200×g离心5 min。加入300μL的洗液使磁珠悬浮，上仪器前震荡3～5 s。分析采集的图谱用Cell Quest软件，而将分析结果换算成浓度则使用BD FACSComp软件。Alb、ALT、TBil、PTA等均在本院检验中心检测，而HBV DNA以及HBV血清学标志物等均在本实验室进行检验。

三、统计学分析

使用GraphPad Prism 5进行统计分析。使用ANOVA方差分析进行组间比较，运用（¯x±s）的形式表示正态分布资料，用Pearson的方法进行临床指标与细胞因子的相关性分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结　果

一、健康对照者及患者的基本临床资料

对健康对照组、CHB组与ACHBLF组患者的临床资料进行比较。在TBil、ALT以及HBV DNA方面的比较结果显示，ACHBLF组的血清中TBil、ALT的含量明显高于健康对照组和CHB组（P=0.023、0.012），HBV DNA低于其它两组（P＜0.001），见表1。

表1　健康对照者及患者临床基本资料

二、健康对照组、CHB组以及ACHBLF组血清中Th1、Th2细胞因子含量的变化

标准品共9个浓度点，整个过程由计算机自动处理，曲线的适配度在95％以上，曲线见图1。

三、CBA检测健康对照者与患者细胞因子浓度对照

对健康对照组、CHB组与ACHBLF组患者的血清细胞因子浓度进行比较。在IL10、IL6、IFNγ、TNFα、IL2以及IL4等方面的比较结果显示，ACHBLF组的血清中含量明显高于健康对照组和CHB组（P=0.014、0.018、0.016、0.017、0.015、0.020），见表2。

四、ACHBLF患者血清中的IFNγ、TNFα及IL4、IL6与TBil、Alb及PTA的相关性分析

ACHBLF患者中，反映肝功能与血清内IFNγ、TNFα及IL4、IL6的含量无显著相关性（P＞0.05）。对TBil、Alb、PTA分别与IFNγ、IL4、IL6、TNFα的相关性进行了Spearman分析，统计结果见表3。

图1Th1、Th2细胞因子拟合曲线

表2　CBA检测健康对照与患者细胞因子浓度

表3ACHBLF患者血清中IFNγ、TNFα及IL4、IL6 与TBil、Alb及PTA相关数据的r值

讨　论

T淋巴细胞可以被分为不同种类，相同的种类又可以分为不同亚群［1］。不同种类的细胞之间依靠所分泌细胞因子的不同而相互促进，相互制约，包括调节性T细胞（Treg）、Th2和Th1［2］。T淋巴细胞还在宿主移植排异、感染性及很多自身免疫性疾病的发生发展中具有重要的意义。近年来，已经有很多研究表明，HBV和HCV的感染过程中有T淋巴细胞的参与，且在HBV感染中影响颇大的Th1和Th2可能影响HBV感染后机体的结局［3］。

细胞因子在抵抗内源性以及外源性的抗原和调节机体自身的状态需求时起到非常重要的作用。细胞因子是由体内的细胞合成以及分泌的多肽。现在检测细胞因子的技术有3种：（1）分子杂交检测；（2）生物活性检测；（3）免疫学直接定量细胞因子［4］。目前最常用的检测方法是ELISA，因生物活性检测以及杂交检测要求的实验条件较高，不是所有的实验室均能满足其所需条件。ELISA具有经济，操作简单等优点，但同时也有缺点，它样本需求量大，精确性低，且1次只能检测1种细胞因子，耗时耗力。CBA是一种多重蛋白的液相定量检测技术，其基本原理为：首先要形成捕获微球，具体做法是在微球上包被捕获的不同荧光强度的抗体，接着和样本溶液混合，样本中能与微球上的抗体特异性结合的蛋白或者抗原就会结合到微球上，然后加入已经荧光标记过的检测抗体，最后放上流式细胞仪对其进行检测［5］。和传统的ELISA法相比，CBA具有很多优点：（1）所需的样本量大大降低，为传统检测的1/6；（2）可以同时检测很多种蛋白，因它是分别针对不同的抗体，且使用了在荧光强度方面各有不同的微球群；（3）稳定性好，有效避免了酶联放大技术容易出现的假阳性［6］。

感染HBV的机体通过正常免疫应答来抵御HBV的继续入侵。在受到抗原刺激后，T淋巴细胞立即分化为Th和细胞毒性T细胞（CTL）。CTL主要通过分泌TNFα以及IFNγ等来清除病毒，通过介导非溶解细胞途径，另一方面也可以通过溶解受感染的细胞来清除靶病毒［7］。由于Th1细胞主要产生IL2以及IFNγ，Th1细胞占优势时，有利于完全清除病毒［8］。Th2细胞分泌的IL4以及IL10等，可以介导体液免疫以及抑制Th1的细胞因子的产生，此时可以使病毒感染呈现缓慢的趋势［9］。当机体的免疫应答异常以及病毒攻击重症肝炎患者时，患者体液免疫功能亢进、B淋巴细胞、T淋巴细胞以及单核巨噬细胞的活性增高。此时CTL细胞增殖分化增多，大量炎症细胞，特别是中性粒细胞，浸润肝组织，使大量的肝细胞出现坏死。

IL2必须与靶细胞膜表面的IL2受体raiL-2R结合才能发挥其正常的生物学功能［11］。患有ACHBLF的患者，细胞膜上sIL2R的含量与正常对照组相比显著升高。sIL2R是活化的淋巴细胞膜上raiL-2R的a链，它和rai L-2R一样，可以结合血液中的IL2，此时血液中的IL2本来含量已经降低，加上sIL2R的竞争结合作用，封闭了细胞因子，使免疫系统功能紊乱加剧，免疫功能更加低下，病情加重［12］。而HBV，HCV等的持续感染使机体产生更多sIL2R，使很多淋巴细胞又被活化，且这种活化效应是不正常的，会使病情恶化［12］。此时大量库普弗细胞活跃增生，单核巨噬细胞大面积浸润，IL6产生增多，而肝脏此时清除IL6的功能已经减弱，清除效果不理想。

在重症肝炎中，IFNγ起到非常重要的作用。当Th1呈现优势应答时，IFNγ的表达水平较高，是引起肝细胞坏死的重要原因。重症肝炎时，TNFα不仅可以通过细胞免疫激活体内的单核巨噬细胞产生更多的TNFα，还可以激活CTL细胞，激活其杀伤作用［13］。此外，它还可以使内皮细胞损伤，通过中性粒细胞的粘附作用。本研究中，ACHBLF组患者的血清IFNγ以及TNFα显著升高，而在CHB组以及健康对照组的血清中，IFNγ和TNFα的含量则非常低。通过分析，造成这一结果的原因可能是重症肝炎时分泌了较多的IFNγ和TNFα，T细胞要清除病毒的感染，从而造成了大量肝细胞的损伤，也使HBV DNA的含量下降。另外一种可能的原因就是ACHBLF患者很容易合并感染，而TNFα是一种促炎因子，感染会使它的含量急剧升高［14］。TNFα和IL4相互协调，共同介导炎症的发展，两者共同升高可以反映全身或者局部感染存在［15］。本研究证实，肝炎时TNFα的血清浓度变化趋势与IL6与IL4相同，可能是由于肝炎患者多合并全身或者局部的感染，促炎因子的升高，发生级联瀑布反应，但具体原因还有待进一步观察。

本研究分析了凝血因子全套指标以及肝功能衰竭指标ALb、TBil等与Th1、Th2细胞因子的关系，结果显示两者并无显著的相关性（P＞0.05）。同时可能由于机体启动了免疫反应，使促炎因子和免疫抑制因子含量急剧升高，使Th1、Th2的变化不完全符合规律。CBA的特异性以及敏感性，还需要进一步的验证。同时上述假设还需要扩大病例进行研究。由于本研究仅限于分析外周血中细胞因子的变化情况，但是外周血中的细胞因子具有多源性，所以它的含量变化并不能直接反映肝脏中Th1、Th2细胞因子的含量变化情况，因此有待进一步检测肝脏中细胞因子的含量来反映患者的细胞因子变化情况。

1李秋菊，党二乐，呼蕾，等.天疱疮和大疱性类天疱疮患者外周血滤

泡辅助性T细胞水平的研究.中华皮肤科杂志，2012，45：155-157.

2戴娟，张光波，高楠，等.炎症性肠病患者外周血辅助性T细胞1和

辅助性T细胞17水平及其临床意义.中华内科杂志，2013，52： 375-378.

3陶凯，沈飞霞，陈景海等.甲状腺肿瘤患者中辅助性T细胞22及白细胞介素-22的变化及意义.中华实验外科杂志，2015，32：147-150.

4Zheng YB，Xie DY，Yan Y，et al.495 Clinical features and dynamic patterns during clinical course of acute-on-chronic hepatitis B liver failure can predict the prognosis of ACHBLF：a retrospective cohort study.J Hepatol，2012，56（Suppl 2）：S194-S195.

5Zheng YB，Huang ZL，Wu ZB.Dynamic changes of clinical features that predict the prognosis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure：a retrospective cohort study.Int J Med Sci，2013，10：1658-1664.

6崔亚杰，管玉洁，刘炜，等.儿童原发免疫性血小板减少症患者外周血滤泡调节性和辅助性T细胞的变化.中华血液学杂志，2014，35：980-984.

7陈勇，唐发清.乙型肝炎及其相关病变中FoxB1检测和临床意义.国际免疫学杂志，2013，36：476-479.

8赵琳，张思敏，黄玲，等.乙型肝炎核心抗体半定量检测值在乙型肝炎诊断治疗中的应用.中华传染病杂志，2014，32：301-303.

9Wang LY，Meng QH，Zou ZQ，et al.Increased frequency of circulating Th17 cells in acute-on-chronic hepatitis B liver failure.Dig Dis Sci，2012，57：667-674.

10Gao S，Ji XF，Li F，et al.Aberrant DNA methylation of G-protein-coupled bile acid receptor Gpbar1 predicts prognosis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure.J Viral Hepat，2015，22：112-119.

11满昌军，董香玉.外周血T细胞亚群、IL-32、IL-6水平在乙型肝炎患者的表达及相关性分析.中国实验诊断学，2014，18：62-65.

12刘映霞，杨桂林，刘琅妮等.乙型肝炎患者自然杀伤细胞G2D受体差异表达及其临床意义.中华传染病杂志，2012，30：421-424.

13郭永红，周云，张颖，等.慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/h2细胞的细胞因子变化及与肝功能指标的关系.检验医学，2014，29：274-278.

14Lin B，Pan CQ，Xie D，et al.Entecavir improves the outcome of acute-on-chronic liver failure due to the acute exacerbation of chronic hepatitis B.Hepatol Int，2013，7：460-467.

15Siddique A，Nelson JE，Aouizerat B，et al.Iron deficiency in patients with nonalcoholic fatty liver disease is associated with obesity，female gender，and low serum hepcidin.Clin Gastroenterol Hepatol，2014，12：1170-1178.

2015-04-16）

（本文编辑：易玲）

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