聚维酮碘作为脱钙骨基质保存剂的实验研究

赵彦涛　胡先同　韩丽伟　白玉龙　衷鸿宾

聚维酮碘作为脱钙骨基质保存剂的实验研究

赵彦涛胡先同韩丽伟白玉龙衷鸿宾

目的 探讨聚维酮碘 （PVP-I）作为脱钙骨基质 （demineralized bone matrix，DBM）长期保存剂的可行性。方法 选用 4 种标准菌种进行 PVP-I 重复 5 次的灭菌效果验证。分别采用 CCK-8 法、PNPP 法、RT-PCR 法检测 PVP-I 对成骨细胞的增殖、前交叉韧带 （anterior cruciate ligament，ACL）活力以及成骨分化标志分子 COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表达的影响；裸小鼠肌间隙植入实验验证 PVP-I 长期保存的 DBM成骨活性是否受到影响。结果 PVP-I 对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭率均为100%，对大肠杆菌的杀灭率为 88.7%；与对照组 （1±0.09）相比，高浓度 PVP-I 抑制细胞生长 （0.63±0.03）（P＜0.05），低浓度 PVP-I 不促进也不抑制细胞增殖；PVP-I 显著增强成骨细胞的 ALP 活力，上调 COL1α、ALP、RUNX2 mRNA 的表达量 （1.25±0.15、1.38±0.14、1.23±0.09）（P＜0.05），对 OCN mRNA 的表达影响不明显；裸鼠肌间隙植入实验表明，PVP-I 长期保存的 DBM 其成骨活性不受影响。结论 PVP-I 有望被开发成DBM 的保存剂。

聚维酮碘；移植，同种；灭菌；小鼠，裸

同种异体骨移植已成为治疗骨缺损的重要手段，脱钙骨基质 （demineralized bone matrix，DBM）的灭菌和保存在其中起到非常关键的作用。现阶段常用的灭菌方法包括：过氧乙酸联合酒精浸泡、环氧乙烷熏蒸、60Co 辐照灭菌等［1］。但这些灭菌方法都会不同程度的损伤 DBM 中的活性成分，影响其成骨活性［2-4］。所以，开发出理想的 DBM 灭菌及保存方法显得尤为迫切。

长期以来，聚维酮碘 （PVP-I）一直作为皮肤及伤口的消毒剂而被应用于临床各科室［5-6］。Zhao等［7］的研究发现，PVP-I 处理能够促进 DBM 的异位成骨能力，但其具体机制尚不清楚。用 PVP-I 长期保存 DBM 后，其成骨活性是否受到影响也不明确。为此，笔者就 PVP-I 处理的 DBM 促进异位成骨的机制以及 PVP-I 长期保存的 DBM 成骨活性是否受到影响进行了研究。

材料与方法

一、实验材料

标准菌株大肠杆菌 （ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌 （ATCC 6538）、枯草杆菌黑色变种芽孢 （ATCC 9732）、白色念珠菌 （ATCC 10231）由美国 ATCC 公司提供，PVP-I （安捷高科 20140302）、DBM （中国人民解放军全军骨科研究所提供）、CCK-8 试剂（同仁化学所，日本 GH802）、PNPP （大连美仑生物A0122A）、Mgcl2 （北京化工厂 10012892）、二乙醇胺 （大连美仑生物 N0514AS）、RT 试剂盒 （宝生生物AK2401）、PCR 试剂盒 （宝生生物 AK3604）、PCR引物 （上海生工合成）方法。

二、灭菌效果验证

1. 菌种的选择：根据国标 GB15981-1995 要求，选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌四种标准菌种进行 PVP-I灭菌效果验证。

2. 灭菌：称量无菌 DBM 共 8 份，每份 1 g，分为对照组和 PVP-I 组，每组 4 份。调整上述菌株菌悬液的浓度为 107 cfu / ml，向每个样品 DBM 中加入该菌悬液 2 ml，4 ℃ 环境下放置 12 h。用无菌生理盐水冲洗 DBM 表面，然后对照组每个样品加入 2 ml 无菌 PBS；PVP-I 组每个样品加入 2 ml 0.5% PVP-I，4 ℃ 放置 24 h。取出 DBM 后用无菌 PBS 冲洗 1 次，然后每个样品加入 10 ml DMEM 培养基，37 ℃ 培养 12 h，收集上清液，进行平板菌落计数。

3. 平板菌落计数：配制营养琼脂培养基 250 ml，高压蒸汽灭菌。取 8 个无菌试管，每个试管中加入20 ml 营养琼脂培养基。待试管中的培养基冷却至45 ℃ 时，将 1.2 中收集到的上清液稀释 1000 倍，取 100 μl 加入试管中。混匀后倒入无菌培养皿中。培养基冷却凝固后将培养皿放入 37 ℃ 培养箱，24 h后取出计数。

4. 灭菌试验重复 5 次。

三、MC3T3 细胞增殖、ALP 活性以及成骨相关蛋白基因的表达

1. 细胞培养：MC3T3-E1 细胞用含 10% FBS 的α-MEM 培养基常规培养。细胞生长达到 80% 融合时，进行传代。用 PBS 清洗细胞 1 次，然后加入0.25% 胰酶进行消化，离心后用含 10% FBS 的 α-MEM培养基重悬细胞。调整细胞密度为 2×104/ ml，接种到培养板中。96 孔板每孔接种 100 μl，12 孔板每孔接种 2 ml。

2. 细胞增殖检测：MC3T3-E1 细胞接种到 96 孔板，37 ℃ 培养 24 h。对照组加入全培，PVP-I 组加入有效碘含量为 320 ng / ml、160 ng / ml、80 ng / ml、40 ng / ml、20 ng / ml 的 PVP-I。37 ℃ 培养后 48 h 加入 10% CCK-8 溶液，其后 2 h，在 450 nm 波长下检测吸光度。

3. ALP 活力检测：MC3T3-E1 细胞接种到 96 孔板，37 ℃ 培养 24 h。对照组加入全培，PVP-I 组加入有效碘含量为 80 ng / ml 的 PVP-I。37 ℃ 培养1 周加入 PNPP 试剂。其后 2 h 加入 0.1 M 的 NaOH终止反应，405 nm 波长下检测吸光度。

4. COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表达检测 MC3T3-E1 细胞接种到 12 孔板，对照组加入全培，PVP-I 组加入有效碘含量为 80 ng / ml的 PVP-I。37 ℃ 培养 72 h，提取细胞总 RNA。RT-PCR 反应检测 COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表达。

四、经 PVP-I 保存后的 DBM 异位成骨实验

1. 材料灭菌：称量 24 份 DBM，每份 0.1 g。分为对照组、PVP-I 24 h 组、PVP-I 12 周组，每组 8 份（n=8）。对照组用60Co 辐照灭菌，辐照剂量 25 KGy。PVP-I 24 h 组用 PVP-I 在 4 ℃ 条件下浸泡 24 h，PVP-I 12 周组用 PVP-I 在 4 ℃ 条件下浸泡 12 周。使用前用无菌 PBS 冲洗 DBM 表面 3～5 次。

2. 裸鼠肌间隙植入实验：裸鼠 24 只，分为对照组、PVP-I 24 h 组、PVP-I 12 周组，每组 8 只。0.3% 的戊巴比妥钠麻醉，俯卧位。局部碘伏消毒。用手术刀在大腿皮肤沿长轴做一 5 mm 切口，眼科镊沿肌间隙将肌肉分开。将材料植入裸鼠肌间隙，缝合肌肉和皮肤。术后 4 周取材，将 DBM 及周围包裹的肌肉取下，进行石蜡切片，HE 染色。观察异位成骨情况。

结　果

一、PVP-I 的灭菌效果

与对照组相比，PVP-I 对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭率均为100%，对大肠杆菌的杀灭率为 88.7% （表1）。

表1 0.5% PVP-I 对几种标准菌种的杀灭效果Tab.1 The sterilization effects of 0.5% PVP-I to standard strains

二、不同浓度 PVP-I 对 MC3T3 细胞增殖的影响

图1 显示：PVP-I 浓度为 320 ng / ml 和 160 ng / ml时，对 MC3T3 细胞的生长有明显抑制作用；当浓度降至 80 ng / ml 时，PVP-I 对细胞生长的抑制作用消失，出现了非常微弱的促增殖作用，但与对照组相比，其作用不明显。继续降低 PVP-I 浓度，并未出现明显促增殖的作用。

图1 PVP-I 对 MC3T3-E1 细胞增殖的影响Fig.1 The proliferation of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

三、PVP-I 对 MC3T3 细胞前交叉韧带 （anterior cruciate ligament，ACL）活力的影响

与对照组 （1±0.05）相比，PVP-I 组 （1.25± 0.04）细胞的 ALP 活力明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.05）（图2）。

图2 PVP-I 对 MC3T3-E1 细胞 ALP 活力的影响Fig.2 The ALP activity of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

四、PVP-I 对 MC3T3 细胞 ALP、COL1α、RUNX2 mRNA 表达的影响

与对照组相比，PVP-I 组细胞的 ALP （1.25± 0.15）、COL1α （1.38±0.14）及 RUNX2 （1.23±0.09）的 mRNA 表达量明显升高，差异有统计学意义 （P＜0.05）。两组的 OCN mRNA 表达量差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图3 PVP-I 对 MC3T3-E1 细胞几种成骨标志分子 mRNA 表达的影响Fig.3 The mRNA expressions of osteogenic molecule of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

五、PVP-I 保存时间对异位成骨能力的影响

图4 显示：经 PVP-I 保存 12 周与保存 24 h 的DBM 均有很强的异位成骨能力分别为：（2.2±0.03）、（2.3±0.05）。与对照组 （1±0.03）相比，差异有统计学意义 （P＜0.05）。

图4 PVP-I 浸泡对 DBM 异位成骨能力的影响 a：对照组；b：PVP-I 浸泡 24 h；c：PVP-I 浸泡 12 周Fig.4 The effects of PVP-I to DBM on its ectopic osteogenesis　a： Control group； b： 24 hours in PVP-1； c： 12 weeks in in PVP-I

讨　论

PVP-I 是碘与表面活性剂络合而成的一种广谱抗菌消毒剂。其渗透性强，刺激性小，杀菌作用时间长，被广泛应用于临床各个科室。骨科常用 PVP-I溶液进行关节或伤口的冲洗［8-9］，往往能取得良好的杀菌效果。已有学者将 PVP-I 应用到组织材料的消毒方面：汪喜顺［10］用 PVP-I 对兔半月板进行金黄色葡萄球菌染菌后的灭菌实验，结果灭菌率达到100%。本实验根据国家标准，选取了 4 种标准菌种进行灭菌验证，其中包括 1 种革兰氏阳性菌 （金黄色葡萄球菌），1 种革兰氏阴性菌 （大肠杆菌），1 种真菌 （白色念珠菌）和 1 种细菌芽孢 （枯草杆菌黑色变种芽孢）。结果显示，PVP-I 对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和枯草杆菌黑色变种芽孢的杀菌率均达到 100%。对大肠杆菌的杀菌率为 88.7%，未能全部杀灭，原因可能有：（1）染菌实验中，菌悬液用有机培养基 DMEM 配制，染菌后 DBM 虽经 PBS 冲洗，但 DBM 表面或内部孔隙还是会不可避免地残留部分培养基，而 PVP-I 在有机物质存在的情况下，杀菌效果会减弱［11］；（2）灭菌时间短，实验中灭菌时间为24 h，延长灭菌时间可能会取得更好的灭菌效果［12］。虽然 PVP-I 对大肠杆菌的灭菌没有达到 100%，但这是在刻意染菌之后的情况。实际生产当中，如果严格控制初始污染菌，DBM 上污染的大肠杆菌数量要远远低于实验中的数据，再结合前期 DBM 处理时酒精的应用，应该会取得良好的杀菌效果。

笔者既往的研究发现，PVP-I 处理的 DBM，其异位成骨的能力有所增加，但其机制尚不明确［7］。本实验从 PVP-I 对成骨细胞增殖和分化的影响入手，对 PVP-I 增强 DBM 异位成骨能力的机制进行研究。结果显示，PVP-I 并不促进成骨细胞的增殖，而高浓度的 PVP-I 反而抑制成骨细胞的生长，这与 Jiang等［13］对于间充质干细胞的相关研究结果是一致的。

ALP 活力是反应成骨细胞分化的一个重要指标［14］。本研究采用 PNPP 法，检测了 PVP-I 对成骨细胞 ALP 活力的影响，结果表明，PVP-I 能够明显增强成骨细胞的 ALP 活力。进一步观察 PVP-I 对成骨细胞 COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 的影响，发现 PVP-I 明显上调 COL1α、ALP 及 RUNX2 mRNA 的表达，这与 Jiang 等［13］的报道一致。但 PVP-I 对 OCN mRNA 的影响不明显，这可能是由于干预时间太短。OCN 属于成骨细胞晚期分化的标志，在矿化形成的时候才开始大量表达［15］。有研究表明，PVP-I 干预成骨细胞后 4 周，与对照组相比，OCN 的基因表达有显著差异［13］。

本研究的前期研究中的异位成骨实验是用PVP-I 处理 DBM 24 h 的结果。要将 PVP-I 作为 DBM的保存剂，需要将 DBM 长期浸泡在 PVP-I 中。这是否会影响其成骨活性，本研究结果表明，DBM在 PVP-I 中浸泡 3 个月，不会影响其成骨活性。笔者还会对 PVP-I 处理更长时间的 DBM 继续进行检测，为 PVP-I 作为 DBM 保存剂的可行性提供更可靠的依据。

综上所述，PVP-I 具有很强的杀菌能力，而且其处理过的 DBM 的成骨活性不降反升，长达 3 个月的保存也不会影响 DBM 活性。这些都为 PVP-I 作为组织材料的保存剂提供了理论依据。通过一系列的实验研究，PVP-I 有望被开发成一种理想的组织材料保存剂。

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（本文编辑：李贵存）

A study of PVP-I as a long term preservation agent for demineralized bone matrix

ZHAO Yan-tao， HU Xian-tong，HAN Li-wei， BAI Yu-ling， ZHONG Hong-bin. Department of Orthopedics， the frst Affliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing， 100048， PRC

ObjectiveTo discuss the feasibility of PVP-I being the preservation of demineralized bone matrix （DBM）. MethodsFour standard strains were used to perform the sterilization experiment in repeated 4 times. PVP-I was added to MC3T3-E1， then cell proliferation and viability were determined by CCK-8 and differentiation status by PNPP and RT-PCR. Muscle implant experiment of nude mice was performed to verify whether the activity of DBM was damaged since it was immersed in PVP-I for a long time. ResultsThe sterilization rates of PVP-I to staphylococcus aureus， monilia albican and bacillus subtilis were all of 100%， while to Escherichia coli 88.7%. CCK-8 assay showed reduced proliferation of the MC3T3-E1 cells when the PVP-I was at a high concentration（0.63±0.03）（P＜0.05）. When the concentration of PVP-I was down-regulated， a negligible effect was observed on MC3T3-E1 growth. PVP-I signifcantly enhanced the activity of ALP and up-regulated the expressions of COL1α， ALP and RUNX2 （1.25±0.15， 1.38±0.14， 1.23±0.09）（P＜0.05）. However， PVP-I did not affect the expression of OCN. The nude mice experiment suggested that the activity of DBM was not infuenced by PVP-I. ConclusionsPVP-I may be applied as the preservation of DBM.

Povidone-iodine；Transplantation， homologous；Sterilization；Mice， nude

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.005

R944.1， R318

国家自然科学基金项目 （81201380）；军事医学项目 （13CXZ028），（AWS14C007）；北京市自然科学基金

100048北京，解放军总医院第一附属医院骨科研究所 （赵彦涛、衷鸿宾）；100048北京，北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心 （赵彦涛、衷鸿宾、胡先同、韩丽伟、白玉龙）；100048北京，北京鑫康辰医学科技发展有限公司科研部 （胡先同、韩丽伟、白玉龙）

2015-08-04）

（7152144）；北京市科技新星项目 （XXJH2015102）；304 医院临床部重点扶持项目 （2014ZD001）