骨粉和脱钙液比例与脱钙时间对脱钙骨基质诱导成骨影响的研究

衷鸿宾　韩丽伟　白玉龙　赵彦涛　李忠海

.组织工程 Tissue engineering.

骨粉和脱钙液比例与脱钙时间对脱钙骨基质诱导成骨影响的研究

衷鸿宾韩丽伟白玉龙赵彦涛李忠海

目的 探索骨粉和脱钙液比例和脱钙时间对脱钙骨基质 （demineralized bone matrix，DBM）诱导成骨活性的影响。方法 以深低温冷冻的供体骨为原材料，剔除软组织、脱脂、清洗、干燥、粉碎等过程制备骨粉；调整脱钙时间以及骨粉和脱钙液的比例，利用 0.5 mol / L 盐酸动态脱钙；清洗、冷冻干燥、辐照灭菌，得到 DBM 样品。对样品进行 pH 值和钙含量测定，从影像学观察显影效果，对其成骨活性进行体内骨诱导验证。结果 测得 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h、DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h 的钙含量依次为 1.86±0.84、0.60±0.22、0.42±0.12、6.84±0.45、2.90±0.32、1.59±0.26；影像学结果显示 DBM-20-0.5 h 材料的显影密度相对最高；裸鼠体内骨诱导组织学观察发现，不同参数制备的 DBM 样品均具有骨诱导活性，且差异无统计学意义 （P＞0.05）。结论 骨粉和脱钙液比例为 1 g / 20 ml，脱钙 0.5 h，即可制得具有稳定的骨诱导活性与一定显影能力的 DBM。

骨基质；矿物质；骨再生；移植，同种；脱钙骨

1668 年，VanMeekren［1］开展了最早的骨移植，自体骨移植因其骨量有限，且需二次手术，随之带来的并发症也限制了其临床应用［2］；异体骨移植资源相对丰富，在美国等发达国家应用最为广泛［3-4］。Urist 等［5］1965 年首次提出脱钙骨基质 （demineralized bone matrix，DBM）有诱导成骨的能力，开创了骨诱导研究的新领域。DBM 的发展在国内也备受关注，很多学者针对 DBM 的制备工艺进行了研究，期望得到既有骨诱导能力又适合工艺生产的技术［6-8］。

脱钙工艺是制备 DBM 的关键步骤［9］，使用盐酸脱钙处理，除去部分或绝大多数钙盐，为营养物质和生长因子的进出提供通道，并保留骨生长所需的生物活性成分。本研究拟对供体皮质骨进行动态脱钙处理，通过调整脱钙时间以及骨粉和脱钙液的比例，制备出具有一定显影能力、钙含量稳定的DBM，加速 DBM 的产业化进程，降低生产成本，保护环境。

材料与方法

一、使用材料

盐酸 （分析纯，20150303，北京化学试剂厂）；过氧化氢 （30%，20140918，北京化工厂）；戊巴比妥钠 （Sigma 公司，美国）、氯化钠注射液 （0.9%，20131226，山东康宁药业有限公司）、10% 中性甲醛 （20140110，北京益利精细化学品有限公司）、纯化水。

超声波清洗器 （KQ250B 型，昆山市超声波仪器有限公司，中国）；pH 计 （Ohaus，starter 3100，美国）；电子秤 （LT 型，上海精密仪器仪表有限公司，中国）；连续光谱测读仪 （Spectra max PLUS 384，Spectra 公司，美国）；分析天平 （XS 105 双量程，梅特勒-托利多仪器有限公司，中国）；恒温振荡器 （THZ-82 型，常州国华仪器设备总厂，中国）；压力灭菌器 （立式，SANYO 公司，日本）；超净工作台 （ZHJH-1214 型，上海智城分析仪器制造有限公司，中国）；电热恒温鼓风干燥箱 （Binder FD 115，BINDER 公司，德国）；标准分样筛 （上海分样筛厂，中国）；组织学包埋机 （Leica EG 1150 H，Leica 公司，德国）；组织学切片机 （Leica RM 2165，Leica 公司，德国）；光学显微镜、图像分析软件（DS-FilC-U3，Nikon 公司，日本）。

裸小鼠 （20±2.0）g，中国人民解放军总医院第一附属医院动物实验中心提供；骨科常用手术器械；X 线摄片机等。

二、实验方法

1. 样品制备：将深低温冷冻供体骨切割后，用高压水流冲洗去除新鲜骨中的骨髓，过氧化氢脱脂，清洗后冷冻干燥，粉碎制备粒径为 282～710 μm骨粉，将不等量的骨粉各放置于不同的容器内；0.5 mol / L 盐酸动态脱钙，中间均换液 1 次，至预定时间取出；纯化水冲洗至洗液 pH 为中性；冷冻干燥后，25 KGy 辐照灭菌。得到 DBM 样品。实验共分为 6 组，固定脱钙时间为 2 h，改变骨粉和0.5 mol / L 盐酸脱钙液的比例，分别为 1 g / 15 ml、 1 g / 20 ml、1 g / 25 ml，得到 DBM 样品 （依次标记为 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h）。固定骨粉和脱钙液的比例为 1 g / 20 ml，动态脱钙时间分别为 0.5、1、1.5 h，得到 DBM 样品 （依次标记为 DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h）（表1）。

2. pH 测定：取 1 ml 固体样品，用新煮沸的蒸馏水 20 ml 稀释，超声震荡 10 min 后，静置 10 min，测其 pH。重复 3 次，取平均值。

3. 钙含量测定：分别精确称取各样品 0.5 g，加混合酸过夜，电炉消化至干透，MilliQ 超纯水溶解残渣，转移至 25 ml 容量瓶定容，取 5 ml 溶液用超纯水稀释定容至 25 ml 成为测试液。火焰原子吸收法测定骨颗粒中钙含量，标准曲线法定量。

4. X 线观察：将实验样品材料在 X 线下观察（曝光条件为：45 kV，100 mA，0.12 s），从影像学评价显影效果。

5. 体内骨诱导试验：以裸小鼠为试验模型，在其腿部肌间隙进行骨诱导实验，植入材料分别为 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h、DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h，共6 组，每组 6 只，共 36 只。0.3% 戊巴比妥腹腔麻醉，分别植入等量的样品。术后 4 周，用 CO2处死裸小鼠后取材，10% 甲醛溶液固定，经过脱钙、脱水、包埋、切片等过程，制成标本切片，HE、甲苯胺蓝染色，对其组织学形态进行观察。按照 OI（osteoinduction）标准［10］进行活性分级 （表2）。

三、统计学分析

表1 实验分组Tab.1 Experiment grouping design

表2 骨诱导评分标准 OITab.2 Osteoinduction （OI）scoring of histologic sections

结　果

一、pH 值和钙含量

测定各个样品的 pH 值和钙离子的含量，结果（表3）显示，随着脱钙液比例的增加，样品的钙含量从 1.86% 降至 0.42%；当骨粉 / 脱钙液为 1 g / 20 ml 时，随着脱钙时间的延长，样品的钙含量明显降低，依次为 6.84%、2.90%、1.59%、0.42%。各个样品的 pH 稳定在 5.92～6.20；相对于骨粉来说，各个样品的钙含量变化显著。

表3 各个样品的 pH 值和钙含量Tab.3 The pH and calcium content of samples

表4 材料骨诱导活性评分 （OI）Tab.4 The scores of bone induction activity by OI

二、X 线观察

X 线观察结果显示 6 个 DBM 样品呈现不同的显影能力。随着脱钙液量的增加，显影密度逐渐降低。当骨粉 / 脱钙液为 1 g / 20 ml 时，随着脱钙时间的延长，显影密度明显下降。其中 DBM-20-2 h、DBM-25-2 h 材料几乎不显影，DBM-20-0.5 h 材料有最高密度影像，该结果与钙含量检测结果相呼应 （图1）。

三、体内骨诱导试验

选用裸鼠模型，进行异位骨诱导实验。术后观察动物伤口处，无肿胀、渗出等不良反应，无明显炎症反应，伤口愈合较好。组织学观察 4 周 （图2），各组均有明显的成骨现象，有新骨、软骨以及类骨髓腔结构形成，且差异无统计学意义 （P ＞ 0.5）。在每个组织块上随机选取 3 个层面制备切片，利用Photoshop 和 Image J 软件计算新骨的生成量，取平均值。OI 标准评分及新骨面积结果见表4。

图1 材料 X 线片图Fig.1 The X-ray of samples

图2 裸鼠术后 4 周组织学观察 （HE ×200）a：DBM-15-2 h；b：DBM-20-2 h；c：DBM-25-2 h；d：DBM-20-0.5 h；e：DBM-20-1 h；f：DBM-20-1.5 hFig.2 Histological findings from the mice after 4 weeks （HE ×200）　a： DBM-15-2 h； b： DBM-20-2 h； c： DBM-25-2 h； d： DBM-20-0.5 h；e： DBM-20-1 h； f： DBM-20-1.5 h

讨　论

骨组织中的无机成分为磷酸盐［11］，本实验通过火焰原子吸收法测定骨颗粒中钙含量为 （24.60± 2.00）wt %，根据化学计量比及离子守恒定律，一个钙离子需要两个氢离子来解离。理论计算得出，1 g 骨粉完全脱钙需要 0.5 mol / L 脱钙液 （24.60± 2.00）ml。实际脱钙过程中，随着反应的进行，脱钙液中氢离子浓度下降，导致脱钙反应速率逐渐下降，为了节约时间成本，在保证脱钙液总量一定的情况下，采用少量多次的换液操作来缩短脱钙时间。为保证脱钙效果，脱钙过程中脱钙液均过量使用。本实验 DBM-15-2 h 组脱钙液用量最少，为30 ml / g （骨粉 / 脱钙液比例为：1 g / 15 ml，中间换液 1 次，脱钙液共计为 30 ml）。各样品 pH 值和钙含量的测定结果显示，各条件下制备的 DBM 均符合行业标准 （Ca%＜8%）［12］。

通过脱钙处理后，DBM 因钙离子的丢失，其X 线的显影效果显著下降，为了便于术中和术后观察，DBM 应具备一定的显影能力；此外，DBM 中残留的钙离子有助于成骨细胞的分化以及矿物质的沉积，对骨修复具有促进作用［13］。X 线下观察 6 种制备的 DBM 发现，DBM-20-2 h、DBM-25-2 h 材料几乎不显影，其余具有不同程度的显影，其中 DBM-20-0.5 h 材料钙含量相对较高为 6.84%，显影效果最好。

骨诱导活性一直是 DBM 制备和使用过程中最关注的问题。DBM 含有多种成骨因子，主要有骨形态发生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP）、β 转化生长因子 （transforminggrowthfaetorp，TGF-β）、成纤维细胞生长因子 （fibroblast growth faetor，FGF）、胰岛素样生长因子 （insulin-like gowth factor，IGF）和血小板衍生生长因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）等。Wildemann 等［14］采用三种不同方法检测了骨中各个成骨因子的含量，有学者测得供体骨制备的 DBM 中人 BMP 总量为 （110.95±48.44）ng / g［15］。本研究选用裸鼠模型，进行异位骨诱导体内实验。术后组织学观察发现，各组均有明显的成骨现象，有新骨、软骨以及类骨髓腔结构形成，且差异无统计学意义。说明动态脱钙工艺［6］在一定范围内调整脱钙液比例或者脱钙时间，即获得可在 X 线下显影的 DBM 样品，也不影响其骨诱导活性。

本实验利用体内试验验证了合理调节骨粉和脱钙液的比例，控制脱钙时间，既可制得具有一定显影能力、钙含量稳定的 DBM，同时也能保证 DBM的骨诱导活性。工艺生产过程中，通过工艺调节降低生产成本，提高工作效率，减少环境污染，这是规模化生产中人们需要关注的重要内容。

本研究结果显示，当骨粉和脱钙液比例为 1 g∶20 ml，动态脱钙 0.5 h，即可制得具有优良骨诱导活性，且具有一定显影能力的 DBM。

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（本文编辑：李贵存）

Preparation of radiopaque demineralized bone matrix by dynamic decalcification process

ZHONG Hong-bin，HAN Li-wei， BAI Yu-long， ZHAO Yan-tao， LI Zhong-hai. Department of Orthopedics， the frst Affliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing， 100048， PRC

ObjectiveTo prepare demineralized bone matrix （DBM）with a stable calcium content and could be displayed under X-ray by accurate control of the decalcification process. MethodsRaw materials were from the donor bone stored in cryopreservation. Hydrochloric acid was used as decalcifcation solution. Soft tissue removal， degreasing， cleaning， drying， grinding and other processes were applied in the preparation of bone powder. Decalcifcation time as well as decalcifcation solution ratio were adjusted， and 0.5 mol / L hydrochloric acid dynamic decalcifcation was performed. DBM sample was obtained after cleaning， freeze drying and irradiation sterilization. The pH value， calcium content and imaging under X-ray were measured. Osteoinductivity was evaluated by implantation test in nude mice. ResultsThe content of calcium of the DBM-15-2 h， DBM-20-2 h， DBM-25-2 h， DBM-20-0.5 h， DBM-20-1 h and DBM-20-1.5 h were 1.86±0.84， 0.60±0.22， 0.42±0.12， 6.84±0.45， 2.90±0.32 and 1.59±0.26，respectively. The brightness of the DBM-20-0.5 h sample was the highest under X-ray. The bone induction activity was seen in 4 weeks. There were no signifcant differences in osteoinductivity in 6 samples （P＞0.05）. Conclusions A stable， radiopaque and osteoinductive DBM can be obtained when bone powder and decalcifcation solution ratio is 1 g / 20 ml （decalcifed 0.5 h）.

Bone matrix；Minerals；Bone regeneration； Transplantation， homologous；Demineralized bone

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.003

R318

国家自然科学基金项目 （81201380）；军事医学项目 （13CXZ028），（AWS14C007）；北京市自然科学基金（7152144）；北京市科技新星项目 （XXJH2015102）；304 医院临床部重点扶持项目 （2014ZD001）

100048北京，解放军总医院第一附属医院骨科、北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心

2015-07-08）