动态高压微射流制备β-乳球蛋白纳米乳液

苏佳琪，何晓叶，高彦祥，袁　芳*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部功能乳品重点实验室，北京100083）

动态高压微射流制备β-乳球蛋白纳米乳液

苏佳琪，何晓叶，高彦祥，袁芳*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部功能乳品重点实验室，北京100083）

该实验以β-乳球蛋白为原料，利用动态高压技术制备β-乳球蛋白纳米乳液。以乳液粒度及其分布、电位为评价指标，确定最佳工艺条件（蛋白浓度、均质压力、均质次数），并研究pH、温度、离子强度、防腐剂等环境因素对乳液体系稳定性的影响。结果表明：β-乳球蛋白质量浓度1.0 g/100 mL、120 MPa高压微射流均质3次为乳液制备的最适条件；乳液的粒径普遍在200 nm左右，且粒径分布较为集中，说明通过该法制备的乳液的均一性较高；该乳液对弱酸性及碱性、盐离子浓度、热及防腐剂均有较好的稳定性，表明β-乳球蛋白乳液具有较高的研究应用价值。

β-乳球蛋白；动态超高压微射流；纳米乳液；乳液稳定性

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是由牛或其他哺乳动物的乳腺上皮细胞合成分泌的一种特殊的乳清蛋白，约占乳清蛋白总含量的50%［1］。天然的β-乳球蛋白是一种由162个氨基酸残基组成、分子质量约为18.4 ku的球形蛋白［2］，由9条反平行的β-折叠和一条α-螺旋组成［3］，具有相对较大的、有序的二级结构和紧密的三级结构。独特的空间结构赋予其特殊的理化特性，其等电点近似于5［4］。在中性的环境条件中，β-乳球蛋白带负电荷，并且能够通过非共价相互作用相结合以二聚体形式存在。β-乳球蛋白具有表面活性，能够吸附在油-水界面形成单一界面层（厚度约为3 nm）［5］，赋予乳液良好的稳定性。然而，β-乳球蛋白易受热处理、碱性条件、高压处理或金属离子的影响而发生变性，其在食品工业中的应用受到严格限制［6］。

动态高压微射流均质技术（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）是一种新兴的物理改性技术。集输送、混合、湿法粉碎、均质等多单元操作于一体［7］，其原理是利用高速剪切、高频振动、对流撞击、瞬时压力下降、空穴作用、短时超高压处理和连续运转的结合作用实现纳米乳液的制备［8］。与传统的高压均质方式相比，微射流均质能够使蛋白的结构和功能特性明显变化，有效改善乳液的界面吸附特性，从而提高乳液的稳定性。

蛋白乳状液可用于封装、保护、传送和释放食品功能因子，且是当前研究的热点［9］。本实验以β-乳球蛋白为研究对象，利用动态高压微射流技术探究乳液制备过程中的工艺条件以及pH值、温度、盐离子浓度、防腐剂等因素对乳状液体系稳定性的影响，为β-乳球蛋白在乳状液中的研究与应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

β-乳球蛋白（纯度＞95%）：美国DACISCO有限公司；芥花籽油：加拿大Harwell公司；苯甲酸钠（食用级）：北京华扬致成科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠等试剂均为分析纯：北京化工厂。

1.2仪器与设备

Ultra-turraxT25高速乳化剪切仪：德国IKA公司；M-110EH高压微射流纳米均质机：美国Microfluidics公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪：英国Malvern公司。

1.3试验方法

1.3.1β-乳球蛋白溶液制备

将β-乳球蛋白（β-Lg）以一定比例溶解于磷酸盐缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌4h，溶胀过夜，于4℃冰箱中储存。

1.3.2β-乳球蛋白粗乳液制备

在高速乳化剪切仪的搅拌下将芥花籽油缓慢加入到上述溶液中，10 000 r/min剪切6 min，形成粗乳液。

1.3.3β-乳球蛋白纳米乳液制备

将以上制备的粗乳液样品通过动态高压微射流纳米均质机在不同均质条件下进一步处理，得到纳米乳液。

1.3.4β-乳球蛋白纳米乳液粒径分析

将纳米乳液用蒸馏水稀释500倍，利用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪在室温条件下对乳液的粒径大小及其分布状况进行分析，经过120 s的平衡时间后采集测量数据，每个样品进行3次平行测量，最终结果以平均粒径（nm）和多分散系数（polydispersity index，PdI）表示。

1.3.5统计分析

实验数据为3次平行测定的平均值。采用SPSS16.0软件的One-Way ANOVA对数据在α=0.05水平下进行显著性分析。

2　结果与分析

乳化过程分为两个步骤：（1）液滴的变性和破坏，使乳液液滴的比表面积增加；（2）通过乳化剂防止液滴的重新聚集，稳定新界面。换而言之，最终的平均粒径取决于液滴的破坏和再聚集行为［10］。利用动态高压微射流制备的乳液是一种非热力学稳定性体系，因此乳液液滴的尺寸在评价乳液的稳定性、外观、质地、流变性和货架期等特性方面意义重大［11］。平均粒径能够表征乳液液滴粒度大小的平均水平，多分散系数（PdI）则体现了乳液液滴粒径的集中分布程度，PdI越小，表明粒径分布越集中。

2.1不同蛋白质量浓度对纳米乳液粒径的影响

制备不同质量浓度β-乳球蛋白乳液，通过液滴平均粒径的变化确定β-乳球蛋白作用的最适质量浓度，试验结果如图1所示。由图1可知，随着乳液中β-乳球蛋白质量浓度的增加（0.5～3.0 g/100 mL），乳液液滴的平均粒径先降低后缓慢升高。当蛋白质量浓度为0.5 g/100 mL时，乳液液滴的平均粒径最大，分析认为此时乳液中的蛋白质量浓度过低，即使全部吸附在油-水界面仍未能达到饱和，溶液中的小液滴因而发生聚合现象，形成粒径较大的液滴。当质量浓度为1.0 g/100 mL时，液滴平均粒径与多分散系数（PdI）同时达到最小值，表明在此条件下蛋白在液滴表面形成紧密的界面膜［12］，乳液液滴粒径相对较小（约为200nm）且其分布较为集中，此时乳液处于相对均一、稳定的状态。当质量浓度从1.0 g/100 mL增加到3.0 g/100 mL时，液滴的平均粒径具有缓慢上升的趋势。说明随着蛋白分子的不断吸附，液滴间相对平衡的状态被破坏，在此条件下，平均粒径主要受均质条件而非乳化剂性能的影响［13］，吸附在不同液滴上的蛋白分子的结合可能造成液滴之间的聚合从而导致总体系中平均粒径的增大。综合以上实验结果，选择质量浓度为1.0 g/100 mL的β-乳球蛋白乳液进行后续研究。

图1　不同β-乳球蛋白质量浓度对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.1 Effect of β-lactoglobulin concentration on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

2.2不同均质次数对纳米乳液粒径的影响

为了最大程度排除均质压力的影响，针对不同均质次数对乳液影响的研究中选取了3个不同的压力，实验结果见图2。结果表明：当压力分别为60 MPa、100 MPa、140 MPa时，随着均质次数的增加，乳液平均粒径均呈现先下降后上升的现象，平均粒径最小值均出现于第3次均质的过程中。而经过3次均质过程产生的乳液具有较低的PdI，表明经此条件制备的乳液稳定性最好。因此确定3次为乳液均质的最佳次数。当均质进行至第4次时，乳液的粒径及相应PdI略有增加，推测可能由于均质过程中提供大量能量导致新液滴的快速重聚集，即“过处理现象”［14］。高频的聚集现象和极高的能量密度是产生“过处理现象”发生的主要原因之一［15-16］。因此，在本实验的后续研究中，对β-乳球蛋白乳液进行3次高压微射流均质处理。

图2　不同均质次数对纳米乳液粒径（A）及多分散系数PdI（B）的影响Fig.2 Effect of homogenization cycles on the particle size（A）and polydispersity PdI（B）of nano-emulsion

2.3不同均质压力对纳米乳液粒径的影响

调节乳状液的均质压力分别为40 MPa、60 MPa、80 MPa、100 MPa、120 MPa、140 MPa，不同均质压力对纳米乳液粒径的影响见图3。

图3　不同均质压力对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.3 Effect of homogenization pressure on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由图3可以看出，随着均质压力的升高，平均粒径依次降低且逐渐趋于稳定。该现象表明一定范围内提高均质压力能够有效提高均质效率。当均质压力较小时，乳液虽然经过均质处理，但对油滴的破碎并不完全，因此无法达到较为理想的均质状态；经过120 MPa均质处理后的乳液液滴平均粒径达到最小值，说明在此压力下，均质效果达到最佳；当压力值超出该范围时继续提高压力，不考虑乳化剂的添加量即β-乳球蛋白的浓度或其在均质室内乳化特性变化时［17］，能够观察粒径的持续降低现象，径降低速度变缓，且维持在一个相对平衡的数值区域间（200～202 nm）。这与CHENG Q等［18］的研究结果一致：随着处理压力的增加，β-乳球蛋白的粒径逐渐减小最终趋于平衡，这种现象可以归因于均质室内对乳液液滴破坏性力量的增加。因此，本实验选取120 MPa作为均质压力条件进行后续研究中乳液的制备。

2.4不同pH环境对纳米乳液粒径的影响

存在于不同食品中的功能因子在加工过程中往往需要经历不同的pH条件，人体胃肠道环境对功能因子的生物转化率和吸收率也具有深远的影响。因此，乳液稳定存在pH范围的确定意义重大。根据上述实验结果确定β-乳球蛋白乳液的最佳制备工艺为：蛋白质量浓度1.0 g/100 mL，120 MPa下均质3次。将制备好的乳状液样品分别调节pH至3、5、7、9、11，样品在室温条件下静置过夜，利用激光粒度仪对乳液的粒径及其多分散系数进行分析，结果如图4所示。

图4　不同pH环境对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.4 Effect of pH conditions on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由图4可知，乳液粒径在pH 5即β-乳球蛋白等电点时达到最大值，分析原因为在等电点时，蛋白质以两性离子的形式存在，溶液中的总净电荷为0，此时液滴间的电荷排斥作用达到最小，易发生聚集现象而形成较大的聚合体，因而平均粒径达到最大值。液滴的多分散系数（PdI）也可佐证。PdI值为0.876，表明乳液中液滴粒径分布极不均匀，大小不一，有的多个小液滴通过结合形成大液滴，有的仍以小液滴的形式存在，因此，在酸性食品体系中该乳液的稳定性较差。随着环境pH的升高（7～11），乳液液滴的平均粒径重新维持在200～210nm之间，且具有较低的PdI值，表明碱性条件对于高压微射流制备的乳液几乎没有破坏能力。而随着环境pH不断扩大（3～11），Zeta-电位也可以提供乳液界面的组成信息［19］。对不同pH乳液的Zeta-电位进行分析，结果如图5所示。

由图5可知，发现乳液液滴带有负电荷，且电位保持缓慢降低，然而并未观察到沉淀或乳析现象，由此可见，通过本法制备的乳液在碱性条件下具有较高的热力学稳定性。

图5　不同pH环境对纳米乳液Zeta-电位的影响Fig.5 Effect of pH conditions on the Zeta-potential of nano-emulsion

2.5不同离子强度对纳米乳液粒径的影响

功能因子可能存在于具有不同盐离子浓度的食品体系中。将制备好的乳液样品分别调节体系离子强度至0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L，室温下静置12 h。测定其粒径及PdI，结果如图6所示。

图6　不同离子强度对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.6 Effect of ionic strength on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

通常情况下，体系中的高离子强度会破坏蛋白质周围的双电层，导致蛋白质剧烈聚集，平均粒径明显升高［20］。由图6可知，由β-乳球蛋白制备的乳状液在一定离子强度范围内，随着离子强度的升高，粒径及PdI基本保持不变。说明该乳液能够在一个较为广阔的盐离子浓度范围内保持相对稳定性。因此，该乳液能够适用于不同离子强度的食品体系。

2.6不同温度及防腐剂浓度对纳米乳液粒径的影响

将制备好的乳液样品分别恒温存放于20℃、40℃、60℃的条件下保持2 h，自然冷却至室温，静止12 h后测量其粒径及PdI的变化，结果如图7所示。

由图7可知，随着处理温度的升高，乳液的粒径及PdI均无明显变化，表明β-乳球蛋白乳液的热稳定性较好，能够耐受一定程度高温的加工贮藏过程。

图7　不同贮存温度对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.7 Effect of storage temperature on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

向制备好的乳液中添加不同浓度（0.01 mol/L和0.1 mol/L）的苯甲酸钠，室温存放12 h，通过激光粒度仪探究不同浓度的防腐剂的存在对于β-乳球蛋白体系稳定性的影响，结果如图8所示。

图8　不同防腐剂浓度对纳米乳液粒径及多分散系数PdI的影响Fig.8 Effect of antiseptic concentration on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由图8可知，苯甲酸钠的添加对β-乳球蛋白乳液的粒径及PdI几乎无影响。由此得出，该乳液对防腐剂的稳定性较好。

3　结论

采用动态高压微射流方法制备β-乳球蛋白乳液，通过研究其粒径及多分散系数（PdI）变化，确定β-乳球蛋白乳液的最佳制备工艺为：蛋白质量浓度1.0 g/100 mL；120 MPa下均质3次。乳液的粒径普遍处于在200 nm左右，且粒径分布较为集中，说明通过该法制备的乳液的具有较高的均一性；该乳液对弱酸性及碱性、盐离子浓度、热及防腐剂均有较好的稳定性，能够满足食品介质特性多样化的需求。本实验为β-乳球蛋白在乳状液中的研究与应用奠定基础；为实现功能因子稳态化及控制释放提供思路；为推动天然食品乳化剂的发展贡献力量。

［1］高学飞，王志耕.β-乳球蛋白应用研究进展［J］.乳品工业，2005（5）：41-44.

［2］BRAUTNIZER G，CHEN R，SCHRANK B，et al.Die sequenzanalyse des β-lactoglobulins［J］.Biol Chem，1973，2:867-878.

［3］JIANG Z M，BRODKORB A.Structure and antioxidant activity of Maillard reaction products from alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin with ribose in an aqueous model system［J］.Food Chem，2012，133（3）: 960-968.

［4］YE A，SINGH H.Electrostatic interactions between lactoferrin and betalactoglobulin in oil-in-water emulsions［J］.Food Colloids，2007，302: 167-175.

［5］LIVNEY Y D.Milk proteins as vehicles for bioactives［J］.Curr Opin Colloid In，2010，15（1-2）:73-83.

［6］TOBIAS S，URI L，JOCHEN W et al.Modulation of physicochemical properties of lipid droplets using β-lactoglobulin and/or lactoferrin interfacial coatings［J］.Food Hydrocolloid，2011，25（5）:1181-1189.

［7］钟俊桢，刘成梅，刘伟，等.动态高压微射流技术对乳清蛋白性质的影响［J］.食品科学，2009，30（7）：106-108.

［8］LIU W，LIU J H，XIE M Y，et al.Characterization and high-pressure microfluidization-induced activation of polyphenoloxidase from Chinese Pear（Pyrus pyrifoliaNakai）［J］.J Agr Food Chem，2009，57（12）:5376-5380.

［9］XU D X，YUAN F，GAO Y X，et al.Influence of whey protein-beet pectin conjugate on the properties and digestibility of β-carotene emulsion duringin vitrodigestion［J］.Food Chem，2014，156:374-379.

［10］FLOURY J，DESRUMAUX A，AXELOS M.A.V et al.Effect of high pressure homogenisation on methylcellulose as food emulsifier［J］.J Food Eng，2003，58（3）:227-238.

［11］DAVID J C.Food emulsions，principles，practice，and techniques［M］. Boca Raton:CRC Press，2005.

［12］ESRA I.Rheological behavior of whey protein stabilized emulsions in the presence of gum arabic［J］.J Food Eng，2002，52（3）:273-277.

［13］JAFARI S M，ASSADPOOR E，HE Y H，et al.Re-coalescence of emulsion droplets during high-energyemulsification［J］.Food Hydrocolloid，2008，22（7）:1191-1202.

［14］SCHULZ M B，DANIELS R.Hydroxypropylmethylcellulose（HPMC）as emulsifier for submicron emulsions:Influence of molecular weight and substitution type on the droplet size after high-pressure homogenization［J］.Eur J Pharm Biopharm，2009，49（3）:231-236.

［15］JAFARI S M，HE Y，BHANDARI B.Effectiveness of encapsulating biopolymers to produce sub-micron emulsions by high energy emulsification techniques［J］.Food Res Int，2007，40（7）:862-873.

［16］JAFARI S M，HE Y，BHANDARI B.Optimization of nano-emulsions production by microfluidization［J］.Eur Food Res Technol，2007，225（5）:733-741.

［17］TCHOLAKOVA S，DENKOV N D，SIDZHAKOVA D et al.Interrelation between drop size and protein adsorption at various emulsification conditions［J］.Langmuir，2003，19（14）:5640-5649.

［18］CHENG Q，MCCLEMENTS D J.Formation of nanoemulsions stabilized by model food-grade emulsifiers using high-pressure homogenization:Factors affecting particle size［J］.Food Hydrocolloid，2011，25: 1001-1008.

［19］XU D X，YUAN F，WANG X Y.The effect of whey protein isolate-dextran conjugates on the freeze-thaw stability of oil-in-water emulsions［J］. J Disper Sci Technol，2010，32（1）:77-83.

［20］THEPKUNYA H，RUNGNAPHAR P，DAVID J C.Influence of pH and ionic strength on formation and stability of emulsions containing oil droplets coated by α-lactoglobulin-alginate interfaces［J］.Biomacromolecules，2006，7（6）:2052-2058.

Fabrication of β-lactoglobulin nanoemulsions by dynamic high-pressure microfluidization

SU Jiaqi，HE Xiaoye，GAO Yanxiang，YUAN Fang*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，Key Laboratory of Functional Dairy，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Using β-lactoglobulin as material，nano-emulsion was prepared through dynamic high-pressure mucrofludization.Choosing emulsion particle size and its distribution，as well as zeta-potential as evaluation indexes，the optimal technological conditions（protein concentration，pressure and homogenization times）were determined，and the effect of pH，temperature，ionic strength and antiseptic on emulsion stability was studied.Results revealed that 1.0 g/100 ml of β-lactoglobulin，homogenized three times under the pressure of 120 MPa were the optimum conditions for emulsion formation.The particle sizes of emulsion were around 200 nm，and the distribution was relatively concentrated，which illuminated that emulsion formatted by this method had higher homogeneity.Besides，emulsion formatted by this process was provided with a good stability.The emulsion also showed good stability under weak acidity and alkalinity，high or low ionic strength，through heating，or adding antiseptic，which indicated that the β-lactoglobulin emulsion had high research and application value.

β-lactoglobulin；dynamic high-pressure microfluidization；nano-emulsions；emulsion stability

TS201.7

A

0254-5071（2015）10-0098-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.022

2015-09-21

国家自然科学基金（31371836）

苏佳琪（1993-），女，本科生，研究方向为食品添加剂。

袁芳（1967-），女，副教授，博士，研究方向为天然产物与功能食品。