液体曲酒母制作工艺研究

隗程峰，陈茂彬，朱正军，姚晓玲*

（湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院，湖北武汉430068）

液体曲酒母制作工艺研究

隗程峰，陈茂彬，朱正军，姚晓玲*

（湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院，湖北武汉430068）

以粉碎的小麦为原料，对液体曲酒母制作工艺进行了研究，将粉碎的小麦加水调浆并进行碳源、氮源及无机盐调配后接种黑曲霉，恒温振荡培养5 d后接种酵母，继续恒温振荡培养一段时间制成液体曲酒母。以液体曲酒母的糖化力和发酵力为评价指标，采用单因素试验和正交试验探讨了可溶性淀粉、NaNO3、KH2PO4及MgSO4添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响。结果表明，当可溶性淀粉添加量12 mg/mL、NaNO3添加量6 mg/mL、KH2PO4添加量4 mg/mL、MgSO4添加量0.5 mg/mL时，液体曲酒母具有最高品质，糖化力和发酵力为245.9 U、3.011 g/（mL·72 h），且在此条件下制作的液体曲酒母流动性好，适于工业化生产。

液体曲酒母；黑曲霉；酵母；糖化力；发酵力

黄酒被称为世界三大古酒之一，其采用糯米为主要原料，由麦曲提供糖化剂和少量发酵剂，再加入酒母提供主发酵剂，经过一段时间的发酵而成，含有氨基酸、糖、醇、有机酸及多种维生素。《天工开物》中指出，“无曲，即佳米珍黍空造不成”，可见麦曲在黄酒的酿造过程中起着相当重要的作用，其制作工艺条件的控制就显得尤为重要。目前，黄酒酿造所用曲主要是生麦曲和熟麦曲两种，而在制曲过程中，生麦曲和熟麦曲的生产都存在着劳动强度大、生产条件难于控制、生产所占场地面积大等缺点［1-4］。

在黄酒的酿造过程中，麦曲为黄酒酿造提供各种酶类（主要是淀粉酶、蛋白酶等），这些酶促使原料所含的淀粉、蛋白质等高分子物质的水解，保证了黄酒发酵的正常进行；同时在制曲过程中霉菌的生长繁殖形成了各种代谢物以及由这些代谢产物相互作用产生的色泽、香味等，赋予黄酒酒体独特的风格，保证了黄酒的品质及营养价值［3-5］。酵母在黄酒酿造中主要起发酵葡萄糖生成酒精的作用，一些研究者也十分重视酵母的选育工作，运用不同的方法选育得到了性状更加优良的酵母，为黄酒口味多样化奠定了理论基础。为综合前人的研究成果，考虑将霉菌及酵母在液体状态下混合培养，制作出既具有糖化力又具有发酵力的液体曲酒母运用于黄酒发酵，从而能够进一步简化黄酒酿造工艺，节约酿造成本［5-15］。

本研究以小麦为原料，将小麦粉碎过目并加水调浆，在液态环境下接入霉菌及酵母并振荡培养以制得液体曲酒母。这种方法减少了杂菌的污染，节约了厂房面积，运用于黄酒生产时简化了黄酒酿造工艺，更加适于机械化黄酒生产。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

小麦、大米：武汉市武泰闸农贸市场；黑曲霉、酵母：本院实验室保存；马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，加水1 000 mL，pH自然。

可溶性淀粉、NaNO3、KH2PO4、NaCl、NaOH、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾（分析纯）：西陇化工股份有限公司；MgSO4、冰醋酸、葡萄糖、CuSO4·5H2O、亚甲基蓝、乙酸钠、浓硫酸、碘液（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；糖化酶、耐高温α-淀粉酶：广州市诺森生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

HK-04A粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；20目筛：浙江上虞市五四纱筛厂；DK-98-11电炉：天津市泰斯特仪器有限公司；FE20型pH计：梅特勒托利多仪器有限公司；LDZX-75KB高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；ZHJHC1214B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；BCD-226冰箱：博西华家用电器有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；SHA-C恒温振荡器：常州国华电器有限公司；AP-01P抽滤机：杭州赛析科技有限公司。

1.3方法

1.3.1霉菌液态种子液的制作

将试管斜面保藏的黑曲霉用10 mL无菌水溶解后，倒入盛有100 mL马铃薯葡萄糖培养基的250 mL锥形瓶中，30℃、180 r/min恒温摇床振荡培养3 d，制成霉菌的液态种子液，备用。

1.3.2酵母液态种子液的制作

将试管斜面保藏的酵母用10mL无菌水溶解后，倒入盛有100 mL马铃薯葡萄糖培养基的250 mL锥形瓶中，30℃、180 r/min恒温摇床振荡培养3 d，制成酵母的液态种子液，备用。

1.3.3液体曲酒母工艺

（1）工艺流程

小麦→除杂→粉碎过20目筛→加水调浆→调配（碳源、氮源、无机盐）→冰醋酸调节pH4.6→煮沸使淀粉糊化→121℃、20min湿热灭菌→冷却后接种霉菌→恒温箱振荡培养5 d后接种酵母→同条件培养2 d→糖化力检测、发酵力检测

（2）操作要点

加水调浆：取粉碎过的小麦4.0 g于250 mL锥形瓶，加50 mL水。

调配：可溶性淀粉补充碳源，硝酸钠补充氮源，磷酸二氢钾、硫酸镁补充黑曲霉生长所需的无机盐。

冰醋酸调pH值：黑曲霉的最适生长pH值为4.6，将冰醋酸与水按1∶15的比例稀释后调节pH值为4.6。

煮沸：在搅拌的状态下煮沸2 min使小麦淀粉糊化。

灭菌：湿热灭菌20 min。

接种霉菌：待温度降至低于30℃后，在超净工作台上接种5 mL黑曲霉种子液。

恒温振荡培养：用两层灭菌纱布封住瓶口，将锥形瓶置于30℃的恒温培养箱中150 r/min振荡培养5 d。

接种酵母：从培养箱中取出，在超净工作台上接种2mL酵母种子液。

同条件培养2 d：将锥形瓶置于30℃的恒温培养箱中150 r/min振荡培养2 d。

1.3.4液体曲酒母优化的单因素试验设计

可溶性淀粉对液体曲酒母的糖化力及液化力的影响：按1.3.3的方法，设定硝酸钠添加量4 mg/mL，磷酸二氢钾添加量2 mg/mL，氯化钠添加量0.02 mg/mL，硫酸镁添加量0.2mg/mL，分别添加可溶性淀粉0、4mg/mL、8mg/mL、12mg/mL、16mg/mL、20mg/mL，考察可溶性淀粉对液体曲糖化力和发酵力的影响。

硝酸钠对液体曲酒母的糖化力及液化力的影响：按1.3.3的方法，设定可溶性淀粉添加量12mg/mL，磷酸二氢钾添加量2 mg/mL，氯化钠添加量0.02 mg/mL，硫酸镁添加量0.2 mg/mL，分别添加硝酸钠2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL，考察硝酸钠对液体曲糖化力和发酵力的影响

磷酸二氢钾对液体曲酒母的糖化力及液化力的影响：按1.3.3的方法，设定可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸钠添加量5 mg/mL，氯化钠添加量0.02 mg/mL，硫酸镁添加量0.2 mg/mL，分别添加磷酸二氢钾0、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，考察磷酸二氢钾对液体曲糖化力和发酵力的影响。

硫酸镁对液体曲酒母的糖化力及液化力的影响：按1.3.3的方法，设定可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸钠添加量5 mg/mL，磷酸二氢钾添加量3 mg/mL，氯化钠添加量0.02 mg/mL，分别添加硫酸镁0、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL，考察硫酸镁对液体曲糖化力和发酵力的影响。

1.3.5液体曲酒母发酵培养基优化的正交试验设计

在单因素试验基础上进行正交试验，以糖化力及发酵力为指标进行L9（34）正交试验，正交试验因素与水平见表1。

表1　液体曲酒母发酵培养基优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for liquid wheat koji and yeast fermentation medium formula optimization mg/mL

1.3.6液体曲酒母的糖化力检测

在35℃、pH4.6的条件下，1mL液体曲1h转化可溶性淀粉生成葡萄糖的质量数（mg）为一个活力单位（U）。

（1）液体曲酒母糖化酶提取

取5 mL液体曲于100 mL容量瓶，加入10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用蒸馏水定容。置于35℃的水浴中振荡提取1 h，过滤，收集滤液备用。

（2）糖化力测定

于甲、乙2个150 mL锥形瓶中各加入25 mL可溶性淀粉，再加入5 mL液体曲糖化酶提取液，乙瓶摇匀后封住锥形瓶口，置于35℃恒温水浴中振荡水解1h后加入1mL20%的NaOH溶液，甲瓶直接加入1 mL 20%的NaOH溶液。两瓶摇匀后吸取5 mL混合液加入另一个盛有菲林试剂甲液、乙液各5 mL的150 mL锥形瓶中，再加入10 mL蒸馏水后置于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下采用1 mg/mL的标准葡萄糖溶液滴至溶液变黄，记录乙瓶消耗的标准葡萄糖体积V2，甲瓶消耗的标准葡萄糖体积V1。糖化力的计算公式如下：

式中：X为试样的糖化力，U；V1为滴定空白时消耗的葡萄糖标准溶液的体积，mL；V2为滴定试样时消耗的葡萄糖标准溶液的体积，mL；1（分子）葡萄糖溶液的质量浓度，mg/mL；30为糖化混合液的总体积（可溶性淀粉25 mL加液体曲提取液5 mL），mL；0.25为5 mL液体曲提取液相当于所取液体曲的体积；5为滴定时吸取的糖化液的体积，mL；1（分母）为酶解时间，h。

1.3.7液体曲酒母的发酵力检测

在30℃、72h内，1mL液体曲酒母利用可发酵性糖类所产生的二氧化碳质量（g）为一个单位，以g/（mL·72h）表示。

（1）糖化液制备

取大米原料60 g，加水300 mL，混匀，加0.4 gα-淀粉酶煮沸20min，使其糊化。冷却至60℃，加入3.2g糖化酶，再加60 mL预热至60℃的水，搅匀，在60℃糖化至取出一滴与碘不显蓝为止，加热煮沸5min，用8层纱布过滤，滤液备用。

（2）灭菌

取若干发酵瓶分别加入50 mL糖化液，塞上棉塞并包上油纸，记录液面高度。同时用油纸包好发酵栓，一起放入灭菌锅中121℃、20 min湿热灭菌。

（3）发酵力测定

灭菌后的糖液冷却至低于30℃，在无菌条件下加入制得的酒母1 mL，留一组作空白对照。发酵栓中加入5 mL浓硫酸封口，用石蜡密封发酵瓶，擦干瓶外壁，置于分析天平称质量，读数为M1（空白试验读数为M3）。置发酵栓于30℃恒温箱发酵72 h，取出发酵瓶，轻轻摇动使二氧化碳全部逸出，再在同一天平称质量，读数为M2（空白试验读数为M4）。发酵力的计算公式如下：

式中：X为试样的发酵力，g/（mL·72 h）；M1为发酵前发酵栓与内容物总质量，g；M2为发酵后发酵栓与内容物总质量，g；M3为空白试验发酵前发酵栓与内容物总质量，g；M4为空白试验发酵后发酵栓与内容物总质量，g。

2　结果与分析

2.1液体曲酒母优化单因素试验结果

2.1.1可溶性淀粉添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响

图1　可溶性淀粉添加量对液体曲糖化力及发酵力的影响Fig.1 Effect of soluble starch addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

从图1可知，当可溶性淀粉添加量为0～12 mg/mL时，所制得的液体曲酒母糖化力及发酵力较低，曲香淡薄，可能是营养物质不够，造成菌种生长缓慢，代谢物质较少。添加量为12 mg/mL时，所制得的液体曲具有最高的糖化力及发酵力，且曲香浓郁。当添加量为12～20 mg/mL时，糖化力、发酵力均呈下降趋势，所制得的液体曲酒母颜色开始出现淡褐色，且酸味开始加重，可能是营养丰富，过早进入衰亡期所致。故选择12mg/mL为最佳可溶性淀粉添加量。

2.1.2硝酸钠添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响

图2　硝酸钠添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响Fig.2 Effect of NaNO3addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由图2可知，当硝酸钠添加量为2～5 mg/mL时，糖化力及发酵力逐渐升高，当添加量继续增加时，糖化力呈下降趋势，而发酵力呈现平缓上升趋势。添加量为5 mg/mL时，液体曲酒母的糖化力及发酵力均达到较佳水平。综合考虑，选择5 mg/mL为最佳硝酸钠添加量。

2.1.3磷酸二氢钾添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响

图3　磷酸二氢钾添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响Fig.3 Effect of KH2PO4addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由图3可知，磷酸二氢钾的添加量对糖化力及发酵力的影响较小，添加量为0～3 mg/mL时，糖化力及发酵力均呈缓慢上升趋势，当添加量为3～5 mg/mL时，糖化力及发酵力呈缓慢下降的趋势。故选择3 mg/mL为最佳磷酸二氢钾添加量。

2.1.4硫酸镁添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响

图4　硫酸镁添加量对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响Fig.4 Effect of MgSO4addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由图4可知，当硫酸镁添加量为0～0.2 mg/mL时，液体曲酒母糖化力及发酵力均呈上升趋势。之后再增加硫酸镁添加量时液体曲酒母糖化力呈下降趋势，而发酵力呈现缓慢上升趋势。综合考虑，选择0.2 mg/mL为液体曲酒母制作的最佳添加量。

2.2液体曲酒母制作工艺优化正交试验

根据单因素试验结果，选择可溶性淀粉添加量（A）、硝酸钠添加量（B）、磷酸二氢钾添加量（C）、硫酸镁添加量（D）4个因素，以糖化力及发酵力为考察指标，进行4因素3水平L9（34）正交试验，试验结果与分析见表2，方差分析见表3、表4。

表2　液体曲酒母发酵培养基优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for liquid wheat koji and yeast fermentation medium formula optimization

表3　以糖化力为考察指标正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments using saccharifying power as evaluation index

表4　以发酵力为考察指标正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments using saccharifying power as evaluation index

从表2可以看出，4个因素对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响由大到小均为可溶性淀粉添加量＞硝酸钠添加量＞硫酸镁添加量＞磷酸二氢钾添加量。且由极差分析结果表明，可溶性淀粉添加量、硝酸钠添加量、磷酸二氢钾添加量、硫酸镁添加量最优的水平组合均为A2B2C3D3，即可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸钠添加量6 mg/mL、磷酸二氢钾添加量4mg/mL、硫酸镁添加量0.5mg/mL。液体曲酒母的糖化力达到245.9U，发酵力达到3.011g/（mL·72h）。

糖化力及发酵力的方差分析（表3、表4）表明可溶性淀粉对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响显著，其他因素的影响均不显著。

从表2可以看出，4个因素对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响由大到小均为可溶性淀粉添加量＞硝酸钠添加量＞硫酸镁添加量＞磷酸二氢钠添加量。且以发酵力及糖化力为考察指标，由极差分析结果表明，可溶性淀粉添加量、硝酸钠添加量、磷酸二氢钠添加量、硫酸镁添加量最优的水平组合均为A2B2C3D3，即可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸钠添加量6 mg/mL、磷酸二氢钾添加量4 mg/mL、硫酸镁添加量0.5 mg/mL。在此条件下进行验证试验，结果表明，液体曲酒母的糖化力可以达到245.9 U，发酵力可以达到3.011 g/（mL·72 h）。糖化力及发酵力的方差分析（表3、表4）表明可溶性淀粉对液体曲酒母糖化力及发酵力的影响显著，其他因素的影响均不显著。

3　结论

液体曲酒母能为黄酒发酵同时提供所需的糖化力和发酵力，以小麦为原料制作液体曲酒母能为黄酒提供特殊的香味物质和营养成分，使黄酒具有绝佳的口感和极高的营养价值。在单因素试验基础上，以液体曲酒母的糖化力和发酵力为考察指标，采用单因素及正交试验，得出结论：液体曲酒母制作是可行的；最终液体曲酒母调配阶段的最佳方案可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸钠添加量6 mg/mL、磷酸二氢钾添加量4 mg/mL、硫酸镁添加量0.5 mg/mL。以此方法制作的液体曲曲香浓郁、流动性好。将其用于工业化黄酒生产不仅易于控制制曲条件，更是简化了黄酒生产工艺、节约了黄酒生产成本，减小了劳动强度，节约了厂房面积，其产业化前景广阔。

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Preparation processing of liquid wheat koji and yeast

WEI Chengfeng，CHEN Maobin，ZHU Zhengjun，YAO Xiaoling*
（College of Food and Pharmaceutical Engineering，Division of Light industry，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

With crushed wheat as raw material，the process of liquid wheat koji was studied.The crushed wheat was added with water，blended with carbon source，nitrogen source and inorganic salt，then inoculated withAspergillus niger.After shaking cultivation at constant temperature for 5 d，wheat koji was inoculated with yeast and then cultivated for a period of time in the constant temperature and shocked environment，the liquid wheat koji and yeast was made.Using saccharifying power and fermenting power of liquid wheat koji as evaluation index，the effect of soluble starch，NaNO3，KH2PO4and MgSO4addition on saccharifying power and fermenting power of liquid wheat koji and yeast was investigated through single factor and orthogonal test.The result showed that the koji has the optimal saccharifying power and fermenting power when the soluble starch，NaNO3，KH2PO4and MgSO4addition in order were 12 mg/ml，6 mg/ml，4 mg/ml，0.5 mg/ml，and the koji and yeast had good saccharifying power of 245.9 U and fermenting power of 3.011 g/（ml·72 h），the yeast made at this condition had good fluidity and was suitable for industrial production.

liquid wheat koji and yeast；Aspergillus niger；yeast；saccharifying power；fermenting power

TS261.1

B

0254-5071（2015）10-0068-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.015

2015-09-01

湖北省科技支撑计划（2013BBA010）

隗程峰（1990-），男，硕士研究生，主要从事食品研究工作。

姚晓玲（1962-），女，教授，博士，主要从事食品研究工作。