酸溶联用发酵技术脱除大米中镉的工艺优化

傅亚平，刘　阳，吴卫国*，王巨涛

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.长沙好韻味实业发展有限公司，湖南长沙410129）

酸溶联用发酵技术脱除大米中镉的工艺优化

傅亚平1，刘阳1，吴卫国1*，王巨涛2

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.长沙好韻味实业发展有限公司，湖南长沙410129）

为了进一步提高大米中重金属镉的脱除率，快速缓解镉超标大米的利用问题，该文采用酸溶-发酵技术脱除大米中的重金属镉，在前期研究的基础上，固定发酵技术参数，研究酸浸条件对镉脱除率的影响。结果表明：乳酸溶液为大米粉浸泡液，浸泡时间12 h，响应面法优化得到的最佳工艺条件为浸泡温度44.2℃，酸液体积分数48%，液料比9∶1（mL∶g）；在最佳工艺条件下处理镉含量为0.647 9 mg/kg的大米，镉的脱除率可达98.01%，与模型预测值相近，且大米粉中镉的残留量远低于国家限量标准。因此，该方法不仅能有效提高大米中重金属镉的脱除率，还能为解决镉超标大米的利用问题提供一定的技术支持。

酸溶技术；镉；大米；发酵；响应面法

中国不仅是稻米的生产大国，更是稻米的消费大国，全国2/3的人口以大米为主食［1］。随着现代工业的快速发展，重金属镉正通过污染土壤侵入大米，大米中镉的污染问题日益严重。由于稻米对镉的富集能力较强，重金属镉可以通过食物链进入人体内，从而对人体产生急性或慢性毒害作用［2］。所以研究如何脱除大米中的重金属镉亟待解决。目前，有关于治理大米中重金属镉污染的报道和技术成果颇多，但主要集中在大米的加工技术方面，如浸泡、蒸煮、砻谷、碾米、大米淀粉的提取和大米蛋白的提取等。一些学者通过试验证明砻谷、碾米、浸泡、淘洗、加热处理都能在一定程度上降低大米中的镉含量，但重金属镉的脱除率较低［1，3-5］。利用碱法或酶法制得大米淀粉和大米蛋白产品后，重金属镉的脱除率虽然可达80%以上，但该方法操作复杂，成本相对较高，且大米淀粉和蛋白产品的品质较差［4］。很多研究认为［6-8］，有机酸可以与重金属镉结合形成可溶性络合物来增加镉的移动性。因此，该研究在前期研究的基础上，固定最佳发酵工艺参数［9］，在进行乳酸菌发酵处理之前，将镉超标的精米先经过酸液浸泡的预处理，研究酸溶联用发酵技术对大米中镉的脱除效果，考察酸浸条件对镉脱除率的影响，并对酸液浸泡条件进行优化，以期进一步提高大米中镉的脱除率。脱镉后的大米粉可以用作饲料工业的粮食原料，为“镉大米”的安全转化提供一定的技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

早籼米（精米，含水率13.41%，镉含量0.647 9 mg/kg）：2013年产于湖南省湘阴县。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（编号：CCC 22737）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（编号：CICC 21805）：湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供。

乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、草酸均为食品级，盐酸（分析纯）、硝酸（优级纯）、高氯酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；MRS肉汤：广东环凯微生物科技有限公司；1 000 μg/mL镉标准溶液：中国计量科学研究院；试验用水均为去离子水。

1.2仪器与设备

Q-100AZ高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；TD5A台式低速离心机：湖南赫西仪器设备有限公司；AUY220电子天平、AA-7000原子吸收分光光度计：日本岛津公司；SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；101A-3ET电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；DK电砂浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；明澈-D24UV超纯水机：美国Milipore公司。

1.3方法

1.3.1酸溶-发酵脱除大米中镉的工艺流程及操作要点

镉超标大米→粉碎过筛→酸液浸泡→离心分离→洗米3次→加菌种发酵→离心分离→洗米3次→干燥→低镉含量的大米粉样品

粉碎过筛：在前期优化发酵试验条件的基础上，取10 g镉含量0.647 9 mg/kg大米粉碎过60目筛。

酸液浸泡：将过筛后的大米粉加入到离心管中，再加入酸液40 mL（pH为1.93），将其摇匀后置于35℃水浴中振荡处理24 h（对照组不进行酸液浸泡处理，直接在相同的条件下接种乳酸菌发酵）（旋转振荡频率为175次/min）。

离心分离：酸液浸泡完后，将混合物以3 500 r/min离心5 min，滤除上清液。

洗米：向滤渣中加入3倍大米粉质量的去离子水，将其充分混匀后离心分离（3 500 r/min、5 min，收集滤渣，加去离子水重复洗米3次。

接种发酵：再向脱水后的大米粉中加入去离子水，去离子水与大米粉的比例为4∶1（mL∶g），混匀后制成大米浆液，将活化后的乳酸菌悬液（乳酸菌浓度达到2×109CFU/mL）分别接种到大米浆液中，植物乳杆菌菌悬液的接种量为2%（V/V），戊糖片球菌菌悬液的接种量为1%（V/V），离心管密封后置于40℃恒温培养箱中静置发酵24 h［9］。

离心分离：待发酵完后，将混合物3 500 r/min离心5 min，滤除发酵液。

洗米：再加3倍大米粉质量的去离子水洗米，将其充分混匀后离心分离（3 500 r/min、5 min），重复水洗3次。

干燥保存：脱水后的湿渣置于45℃热风干燥箱中干燥至恒质量（水分含量为11%～13%），用自封袋密封后放置于4℃冰箱中保存备用［9］。

1.3.2酸液种类的确定

考察乳酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、酒石酸、草酸、盐酸对大米中重金属镉的脱除效果，初步固定酸液pH值为1.93（各酸的体积分数根据此pH确定），酸浸温度为35℃，浸泡时间为24 h，液料比为4∶1（mL∶g）的试验条件，通过比较大米中镉的脱除率，从而确定出最佳的酸液种类。

1.3.3单因素试验

用酸溶技术联合乳酸菌发酵技术脱除大米中的重金属镉，在前期试验中已确定最佳的发酵工艺条件，在1.3.1工艺条件下，以1.3.2确定的酸液种类为浸泡液，分别考察酸液体积分数、浸泡温度、浸泡时间和液料比4个因素对重金属镉的脱除率的影响。

1.3.4响应面法试验设计及验证性试验

由单因素试验确定影响镉脱除率的主要因素和最佳水平范围，根据Box-Behnken响应面法设计3因素3水平试验，选择浸泡温度（40℃、45℃、50℃）、酸液体积分数（30%、40%、50%）和液料比（6∶1、8∶1、10∶1（mL∶g）），计算大米中镉的脱除率。利用Design-Expert8.0.6软件分析获得最佳的工艺参数，在最优的工艺条件下进行验证性试验。所有试验均重复3次，所有数据均平行测定3次，用SPSS软件进行方差分析。

1.3.5镉标准曲线的绘制

参照国标方法并作改进，在以2 μL（20 g/L）磷酸二氢铵溶液作为基体改进剂的条件下，绘制吸光度值与镉含量的标准曲线，得到线性回归方程为：

式中：C表示样品中镉的质量浓度，ng/mL；A表示样品的吸光度值［9-10］。

1.3.6镉含量的测定流程及要点

称样→湿法消解→赶酸→定容→上机测定→计算镉含量

称样：用天平称取大米粉样品约0.5 g，精确至0.000 1 g，置于50 mL锥形瓶中。

湿法消解：向盛有样品的锥形瓶中加入10 mL消解液（硝酸8.5 mL+高氯酸1.5 mL），加盖浸泡过夜，次日于沙浴锅上消解，若黄烟冒尽，消化液仍呈浑浊状，则应再加入消解液继续消化，直至消化液呈无色透明或淡黄色。

赶酸：待样品消化完后，置于电热板上赶酸，直至白烟冒尽溶液呈淡黄色或无色透明近干为止，取下放冷，加入少量去离子水置于电热板上再次赶酸，待白烟冒尽溶液近干，取下放冷。

定容：用去离子水将锥形瓶中消化液转移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，混匀备用。

上机测定：参照国标GB 5009.15—2014《食品中镉的测定》方法并作改进，在以2 μL（20 g/L）磷酸二氢铵溶液作为基体改进剂的条件下，利用石墨炉原子吸收光谱法对重金属镉元素进行测定［9-10］。大米粉样品中的镉含量计算公式如下：

式中：X为样品中镉含量，mg/kg；A1为样品消化液中镉的质量浓度，ng/mL；A2为空白液中镉的质量浓度，ng/mL；V为样品消化液总体积，mL；m为样品质量，g。

大米粉样品中的镉脱除率计算公式如下：

式中：Y为样品的镉脱除率，%；X1为原料米中的镉含量，mg/kg；X2为样品中的镉含量，mg/kg。

2　结果与分析

2.1酸液种类的确定

初步固定酸浸条件为酸液pH值1.93，浸泡温度35℃，浸泡时间24 h，液料比4∶1（mL∶g）。分别选择乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸和盐酸7种酸，考察不同酸处理对大米中镉的脱除率的影响，结果见图1。

图1　酸种类对镉脱除率的影响Fig.1 Effect of acid species on removal rate of cadmium

由图1可知，利用上述7种酸液在相同条件下联合发酵技术分别处理同一种大米后，重金属镉含量均显著降低，且镉的脱除率均高达70%以上。除草酸外，其余6种酸所对应的镉脱除率均显著高于对照组（P＜0.05），说明在乳酸菌发酵大米之前，先利用乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或盐酸对大米进行浸泡预处理，能显著降低其中的镉含量。这可能与酸液形成的低pH环境有关［1］，酸液的浸泡作用能使大米粉颗粒结构变疏松［11］，酸液的残留能降低发酵液的初始pH，加快乳酸菌的生长繁殖，进一步促进大米中镉元素的溶出。乳酸使镉脱除的效果要胜过无机酸盐酸以及其他有机酸乙酸、柠檬酸、酒石酸等，并且这7种酸的pH相同，这说明对重金属镉元素的溶出不主要是酸中氢离子的作用，可能与乳酸的分子结构有关［12］，乳酸分子内部具有α-羟基和羧基，有报道指出羧基与多肽链上的氢形成氢键以及α-羟基中的氢与多肽链上的氧形成氢键是促进蛋白质溶出的原因［12］，从而使大部分镉元素以蛋白质结合态形式一起溶出。因此，选择乳酸溶液作为后续试验的浸泡液。

2.2单因素试验结果与分析

2.2.1酸液体积分数对镉的脱除效果的比较

在确定乳酸为酸浸泡液后，固定浸泡温度为35℃，浸泡时间为24 h，液料比为4∶1（mL∶g）的试验条件，研究乳酸体积分数分别为1%、10%、20%、30%、40%和50%时，大米中重金属镉的脱除率。乳酸体积分数与镉脱除率之间的关系见图2。

图2　乳酸体积分数对镉脱除率的影响Fig.2 Effect of lactic acid concentration on the removal rate of cadmium

由图2可知，当乳酸体积分数增加至40%时，镉的脱除率最高，随着乳酸体积分数的进一步增加，镉脱除率反而下降。这可能是因为乳酸体积分数过大导致浸泡液黏度增加，使溶质的扩散能力降低，从而造成镉脱除率下降［13］。乳酸体积分数对镉脱除率的影响显著（P＜0.05），且试验组对应的镉脱除率均显著高于对照组（P＜0.05），这说明，当乳酸体积分数为1%～50%时，利用乳酸联用发酵技术比单独用乳酸菌发酵技术的脱镉效果好，且最优的乳酸体积分数范围为30%～50%。

2.2.2浸泡温度对镉的脱除效果的比较

固定酸液种类为乳酸，酸液体积分数为10%，浸泡时间为24 h，液料比为4∶1（mL∶g）的试验条件，分别选择浸泡温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃6个水平进行比较试验，考察浸泡温度对镉脱除率的影响，结果见图3。

图3　浸泡温度对镉脱除率的影响Fig.3 Effect of leaching temperature on the removal rate of cadmium

由图3可知，浸泡温度对镉脱除率的影响显著（P＜0.05），且对照组的镉脱除率显著低于试验组（P＜0.05），再次说明大米在乳酸菌发酵之前，先经过酸液的浸泡预处理，能进一步显著提高镉的脱除率（P＜0.05）。当酸浸温度达到45℃时，镉的脱除率最高。浸泡温度过低时，溶质的扩散速度下降，镉的迁移速率也随之降低［13］；浸泡温度过高时，大米粉中部分淀粉糊化，增加了溶液的黏度，使溶质的扩散能力降低，糊化的淀粉颗粒更容易吸水膨胀，形成紧密的凝胶网络，并包埋住蛋白质和矿物质元素，从而抑制镉的溶出［11］。因此，选择40～50℃为浸泡温度的优化范围。

2.2.3浸泡时间对镉的脱除效果的比较

固定酸液种类为乳酸，乳酸体积分数为10%，浸泡温度为35℃，液料比为4∶1（mL∶g）的试验条件，分别选择浸泡时间为6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h 6个水平进行比较试验，考察浸泡时间对镉脱除率的影响，结果见图4。

图4　浸泡时间对镉脱除率的影响Fig.4 Effect of leaching time on the removal rate of cadmium

由图4可知，浸泡时间对镉脱除率影响不显著（P＞0.05），且试验组的镉脱除率均显著高于对照组（P＜0.05）。利用10%乳酸溶液作为试验浸泡液时，随着酸浸时间的增加，镉的脱除率逐渐增加，当浸泡时间达到12 h时，随着酸浸时间的进一步增加，镉的脱除率并没有显著增加（P＞0.05），因此，从考虑能耗和经济效益的角度出发，后续试验的酸浸时间选择12 h为宜。

2.2.4液料比对镉的脱除效果的比较

固定酸液种类为乳酸，酸液体积分数为10%，浸泡温度为35℃，浸泡时间为24 h的试验条件，分别选择液料比为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1和10∶1（mL∶g）6个水平进行比较试验，考察液料比对镉脱除率的影响，结果见图5。

图5　液料比对镉脱除率的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on the removal rate of cadmium

由图5可知，液料比对镉脱除率的影响显著（P＜0.05），除液料比为1∶1（mL∶g）外，其余试验组的镉脱除率均显著高于对照组（P＜0.05）。这说明，在大米粉质量一定的情况下，浸泡酸液的体积过小会影响后续发酵试验的脱镉效果。从图5可知，随着液料比的增大，酸液量增多，大米粉颗粒与酸液充分接触，镉的溶出量也逐渐增大，当液料比达到8∶1（mL∶g）时，随着液料比的继续增加，镉脱除率的增加不显著（P＞0.05），此时，镉的溶出量已基本达到饱和。因此，综合考虑经济效益问题，选择优化的液料比范围为6∶1～10∶1（mL∶g）为宜。

2.3响应面优化试验

2.3.1响应面试验分析和多元二次回归方程的建立

在单因素试验的基础上，对浸泡温度、酸液体积分数和液料比3个因素进行优化，以镉脱除率为响应值设计3因素3水平的响应面分析试验，总共17个处理组，Box-Behnken试验设计方案与结果见表1。

表1中的试验结果经过Design-Expert8.0.6软件中的ANOVA程序分析后，得到各影响因子对响应值影响的多元回归方程模型为：

Y=97.59+0.47A+1.27B+0.30C+0.21AB-0.14AC-0.25BC-0.98A2-0.49B2-0.37C2，对拟合的回归方程进行方差分析和回归系数的显著性检验，结果如表2和表3所示。

表1　Box-Behnken试验设计方案与结果Table 1 Experimental design and results of Box-Behnken

表2　回归模型的方差分析Table 2 Analysis of variance for regression model

表3　回归系数的显著性检验Table 3 Regression coefficients and their significance

通过表2可以看出，该回归方程模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），且模型决定系数R2=0.995 9，校正决定系数R2Adj=0.990 6，说明回归方程的拟合度较好，失拟性小，能够真实的反映出镉脱除率与浸泡温度、酸液体积分数和液料比之间的关系［14-16］。因此，可以用该模型代替试验真实点对镉脱除率进行分析和预测。

由表3可知，对回归方程模型进行方差分析，模型的一次项A（浸泡温度）、B（酸液体积分数）、C（液料比）、交互项AB、BC及二次项A2、B2、C2对响应值Y（镉脱除率）的影响极显著（P＜0.01），表明浸泡温度、液料比和酸液体积分数都是影响镉脱除率的重要因素。比较表3中各因素的F值大小，可知3个因素对镉脱除率影响的主次顺序为乳酸体积分数＞浸泡温度＞液料比。由P值可知，浸泡温度（A）和酸液体积分数（B）的交互作用以及酸液体积分数（B）和液料比（C）的交互作用对镉脱除率的影响极显著，液料比（C）和浸泡温度（A）的交互作用对镉脱除率的影响不显著。

2.3.2模型交互作用分析

为了更直观地反映两两因素间的交互作用对镉脱除率的影响，利用Design-Expert.8.0.6软件作出浸泡温度、乳酸体积分数与镉脱除率以及液料比、酸液体积分数与镉脱除率构成的等高线图和响应曲面图，结果如图6所示。

图6乳酸含量、浸泡温度、液料比交互作用对镉脱除率影响的等高线和响应面Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between lactic acid concentration，leaching temperature，liquid-solid ratio on cadmium removal ratio

图6直观地反映了浸泡温度与乳酸体积分数的交互作用及乳酸体积分数与液料比的交互作用。由图6中的响应曲面图可以看出，在设定的试验条件范围内，固定乳酸体积分数为某一值，镉的脱除率随着浸泡温度的上升呈现先增加后下降的变化趋势，这可能是因为温度过低时，溶液中分子的运动和扩散速度降低，温度过高时，大米粉中部分淀粉糊化，导致溶液黏度增加，镉的迁移量减少［11，13］；固定浸泡温度为定值时，镉脱除率随着乳酸体积分数的增加而增加，当乳酸体积分数为50%、浸泡温度在45℃附近时，镉脱除率出现最大值；在设定的试验条件范围内，固定液料比为某一定值，随着乳酸体积分数的增大，镉的脱除率不断增大；固定乳酸体积分数为某一值时，随着液料比的不断增大，镉脱除率也呈现先增大后减小的趋势，当乳酸体积分数为50%、液料比在8∶1（mL∶g）附近时，镉的脱除率有最大值。因此，乳酸体积分数是影响镉脱除率的主要因素，这可能是因为酸液的浸泡作用能使大米粉颗粒结构变疏松，乳酸的残留能降低发酵液的初始pH值，加快乳酸菌的生长繁殖，进一步促进大米中镉元素的溶出［11］。

2.3.3工艺条件的优化与验证

由回归方程预测的最佳工艺条件为：浸泡温度44.15℃，乳酸体积分数48.10%，液料比8.62∶1（mL∶g），且模型预测的镉脱除率的最大值为98.17%。考虑到实际操作的可行性，将最佳工艺条件调整为：浸泡温度44.2℃，乳酸体积分数48%，液料比9∶1（mL∶g），在修正后的最佳工艺条件下进行3次重复验证试验，测得镉脱除率的均值为98.01%，相对标准偏差为1.18%，且实际值与理论值之间的拟合性较好，说明基于该回归模型得到的优化工艺参数是合理可靠的。在酸浸发酵后的大米粉中，镉的残留量为0.012 89 mg/kg，低于国家限量标准0.2 mg/kg。

3　结论

该文利用酸溶-发酵技术脱除大米中的重金属镉，在前期研究的基础上，固定发酵技术参数，研究酸液浸泡条件对镉脱除率的影响。通过对比试验发现乳酸溶液为适宜的大米浸泡液，单因素试验结果表明：液料比、浸泡温度和乳酸体积分数对镉脱除率的影响极显著（P＜0.01），影响的主次顺序为乳酸体积分数＞浸泡温度＞液料比，其中浸泡时间影响不显著（P＞0.05），因此，在后续试验中固定浸泡时间为12 h。响应面法优化得到的最佳工艺条件为：浸泡温度44.2℃，乳酸体积分数48%，液料比9∶1（mL∶g）；此条件下处理镉含量为0.647 9 mg/kg的大米，测得的镉脱除率为98.01%，大米粉中镉的残留量为0.012 89 mg/kg，低于国家限量标准0.2 mg/kg。而对照组大米不经过酸液浸泡，直接采用乳酸菌发酵技术处理，镉的脱除率只有85.73%，说明大米在一定条件下经过乳酸溶液浸泡后，能有效提高后续乳酸菌发酵脱镉的效果。因此，该方法不仅能有效提高大米中重金属镉的脱除率，还能为解决镉超标大米的利用问题提供一定的技术支持。

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Optimization of acid leaching process combined fermentation technology for cadmium removal in rice

FU Yaping1，LIU Yang1，WU Weiguo1*，WANG Jutao2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Changsha Haoyunwei Industrial Development Co.，Ltd.，Changsha 410129，China）

In order to further improve the removal rate of cadmium in rice and rapidly relieve the cadmium excessive rice utilization，in the paper，the heavy metal cadmium in rice was removed by acid leaching-fermentation technology.On the basis of previous researches，fermentation parameters were fixed，the effect of acid leaching conditions on the removal rate of cadmium was studied.The results showed that lactic acid was selected as suitable leaching solution from seven kinds of acids，and leaching time was selected as 12 h.The optimum acid leaching conditions were obtained with leaching temperature 44.2℃，acid concentration 48%，liquid-solid ratio 9∶1（ml∶g）by response surface method.Under the optimal conditions，rice with 0.647 9 mg/kg cadmium was treated，and the cadmium removal ratio was 98.01%，which was close to the predictive value.And the cadmium residue content in processed rice powder was much lower than the National limits.Thus，this method not only can efficiently improve the removal rate of cadmium in rice，but also could provide a certain technical support to resolve the problem of cadmium excessive rice utilization.

acid leaching technology；cadmium；rice；fermentation；response surface method

TS210.4

A

0254-5071（2015）10-0062-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.014

2015-09-14

湖南省高等学校“2011”协同创新中心项目（湘教通［2013］448号）；长沙市科技重大专项（K404036-21）；“重金属污染耕地治理修复机理及技术模式优化集成”项目（农办财函［2015］38号）

傅亚平（1990-），女，硕士研究生，研究方向为粮食深加工及开发利用。

吴卫国（1968-），男，教授，博士，研究方向为粮食深加工及开发利用。