黄瓜疫霉菌拮抗菌的筛选及鉴定

周 珍，向 阳，解 娜，易图永,3

（1. 湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2. 永顺县农业局，湖南 永顺 416700；3. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙410128）

黄瓜疫病是由黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）引起的黄瓜主要病害之一，在黄瓜种植区的发生日趋严重。据统计，青海[1]、海南[2]、江苏[3]等地的黄瓜栽培区都曾大面积发生黄瓜疫病，造成黄瓜的产量减少和口感下降，严重打击了农民种植黄瓜的积极性[4]。目前，对该病的防治以化学农药为主[5]，但某些药剂存在毒性大、残留时间长、容易诱导病原物产生耐药性等缺点[6-7]，不宜长期大量使用。而生物防治具有低残留、高效等优点，已成为防治植物病害的发展趋势[8]。在诸多生物防治策略中，利用拮抗微生物或其次级代谢产物防治作物病害的报道较多[9-10]。其中，放线菌因来源广、代谢产物活性高等优势受到广泛关注[11]。据报道，由微生物产生的20 000 多种活性物质中近一半来源于放线菌[12]。但目前放线菌应用于黄瓜疫病防治的报道还比较少见。研究采用平板稀释法[13-14]、平板对峙法[15-16]等从土壤中筛选到5 株对黄瓜疫霉菌有较好拮抗作用的放线菌株，并对拮抗作用最强的菌株No.2 做了发酵液的初步拮抗试验及生理生化特性的研究，以期为黄瓜疫病的生物防治提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2011～2013年进行。黄瓜疫霉菌TX-8（Phytophthora melonis）由湖南农业大学植物保护学实验室提供。土壤样品分别从贵州黄果树国家重点风景名胜区、湖南新宁崀山风景区、张家界国家森林公园收集200～250 g，放置在4℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤放线菌的分离 将土壤样品干燥、研磨后，采用平板稀释法分离。称量10 g 土样装入含90 m L 无菌水的300 m L 锥形烧瓶中，用小玻璃珠均匀振荡30 min，即为10-1稀释液。静置数秒后，以10-1稀释液为母液依次制备10-2～10-6稀释液。分别取0.1 m L 各浓度稀释液滴加到高氏一号培养基上28℃倒置培养，设3 次重复。

1.2.2 拮抗放线菌的筛选 采用平板对峙法。将直径为7 mm 的黄瓜疫霉菌块放置于PDA 平板中央，菌块四周对称接种平板稀释法分离得到的放线菌，28℃倒置培养。7 d 后观察抑菌带长度，保存拮抗作用明显的菌株。

1.2.3 发酵液对黄瓜疫霉菌的拮抗作用 将上一步保存的菌株接种到高氏一号培养基上，28 ℃、180 r/m in 在摇床上培养7 d。培养液用0.22 μm 细菌滤液器过滤。取5 m L 滤液与20 m L 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基混匀后倒板，平板中央放置直径为7 mm 病原菌，放入28℃温箱倒置培养，以无菌水处理作为对照，每组3个重复。抑制率计算公式如下：

病原菌菌丝直径=交叉垂直直径的平均值

抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1.2.4 抑菌谱测定 以拮抗效果最好的放线菌为材料，将直径为7 mm 的黄瓜疫霉病菌块，放置在PDA平板中央，两边对称接种拮抗菌置于28℃温箱培养6～8 d。采用相同方法对水稻瘟稻病菌（Magnaporthe oryzae）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioides）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）进行抑菌测定。

1.2.5 拮抗菌的鉴定 （1）菌落形态和培养特征鉴定。将供试菌株划线接种在多种基础固体培养基上于28℃恒温箱培养，分别在5、7、10、14 d 时于光学显微镜下观察拮抗菌的形态、气生菌丝、基质菌丝和有无色素；观察孢子的形态、特征及是否有横向断裂横隔。（2）生理生化鉴定。参照《链霉菌鉴定手册》分别对拮抗菌进行碳源利用、淀粉水解、明胶液化、牛奶胨化和凝固、纤维素上生长、硫化氢的生成等各项试验。（3）分子生物学鉴定。采用改良的SDS 法提取放线菌的基因组DNA，采用16S rRNA 通用引物进行PCR 反应，正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1 492R：5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’。PCR 反应体系（20 μL）为10×PCR Buffer 2 μL，1.25 mmol/L dNTPs 0.8 μL，引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，TaqDNA 酶0.5 μL，用去离子水补足至20 μL。PCR 扩增条件为94℃5 m in；94℃40 s，51℃40 s，72℃90 s，30 次循环；72℃5 m in。PCR 产物胶回收后连入pGM-T 载体，并转入TOP10 感受态细胞。挑选单菌落进行菌液PCR 鉴定后送上海生工生物工程股份有限公司测序。所得序列在NCBI 中进行BLAST分析比对，利用Mega5 软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的筛选

收集土壤样品经过处理后，采用稀释法分离得到放线菌菌株106 株，细菌菌株126 株。采用平板对峙法，以黄瓜疫霉菌为指示菌进行拮抗活性测定，获得26 株对黄瓜疫霉菌有拮抗作用的菌株，占总菌株的11.2%，其中抑菌带达到5 mm 及以上的拮抗菌有5 株。

2.2 发酵液对黄瓜疫霉菌的拮抗作用

对上一步筛选到的5个菌株发酵培养后，5 倍稀释发酵滤液进行抑菌活性检测（表1）。结果发现2 号菌株对黄瓜疫霉菌的抑制率高达76%（图1）。

2.3 抑菌谱检测

为进一步研究2 号菌的生物防治价值，采用对峙法对其他病原菌进行拮抗效果测定。其中，对烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、柑橘炭疽病菌和稻瘟病菌等都表现出不同程度的拮抗效果，抑菌率为55%～75%。

2.4 拮抗菌的分离鉴定

2.4.1 形态特征 2 号菌在高氏一号培养基上最初呈白色，7 d 后菌落呈烟灰色（图2），单菌落圆形，表面干燥。通过光学和电子显微镜观察到孢子丝长而直，边缘有成丛的趋势，不产生螺旋孢子丝，孢子柱形或长圆形，表面光滑，不透明，常在气生菌丝上形成长孢子链（图3）。

表1 有效菌株对黄瓜疫霉菌的抑制作用

图1 2 号菌株对黄瓜疫霉菌的抑制效果

图2 拮抗菌株2 号菌的培养特征

图3 电镜下2 号菌的孢子形态

2.4.2 培养特征 不同培养基上2 号菌气生菌丝颜色不一致，在高氏一号培养基上长时间生长后菌丝变厚，呈烟灰白。在察氏、PDA 培养基上气生菌丝分别呈灰色、白色，有可溶性色素（表2）。

表2 各类培养基上拮抗菌株2 号菌的培养特征

2.4.3 生理生化特性 对2 号菌株的生理生化特性测定结果表明（表3），该菌株能利用D-半乳糖、乳糖、甘露糖、山梨糖、麦芽糖、D-木糖、蔗糖，但不能利用鼠李唐、山梨醇、甘露醇，对L-阿拉伯糖的利用还有待进一步确认；2 号菌株能使明胶液化，不能分解纤维素，但能在纤维素培养基上生长，淀粉水解能力较强，不能使牛奶胨化凝固，不产生硫化氢，能产生过氧化氢酶，吲哚试验中未出现红色环状物。

2.4.4 分子生物学鉴定 2 号菌株16S rDNA 扩增获得一条1 500 bp 左右的单一带，测序结果与NCBI 数据库进行对比，选取10 株模式链霉菌属菌株用Mega5 软件构建系统进化树（图4），结果显示，2 号菌株与绛红褐链霉菌（S. purpeofuscus）在同一分支，同源性高达99%。同时结合培养特征习性、生理生化特征分析及分子测定结果。

表3 2 号菌株的生理生化特征

图4 16S rDNA 序列分析构建的系统发育树（邻近法）

3 结论与讨论

黄瓜疫病俗称死藤、瘟病等，在黄瓜整个生育周期均可发生。此病常造成黄瓜大面积死亡，轻者减产30%～40%，严重时甚至绝收。目前，对黄瓜疫病的防治主要以化学防治为主，但其对人畜的毒副作用和残留问题至今难以有效解决。为解决化学药剂带来的诸多问题，生防菌对植物病原菌的抑制研究已成为热点。目前，已发现许多对植物病害具有防治作用的生防细菌，其中以假单胞杆菌[17]（Pseudomonas spp.）、芽孢杆菌[18-19]（Bacillus spp.）和链霉菌[20-21]（Streptomyces spp.）等居多。由于国内外对黄瓜疫病的生防菌研究较少，在众多已发现的生防菌中，目前仅发现华丽黄链霉菌[22]（Streptomyces flaveus）、枯 草 芽 孢 杆 菌[23]（Bacillus subtilis）等少数菌株对黄瓜疫霉菌有较好抑制作用。

研究通过平板对峙法及发酵液抑菌试验，从土壤中筛选到5 株对黄瓜疫霉菌有较好拮抗作用的放线菌株，其中拮抗菌No.2 对黄瓜疫霉菌表现出最强的拮抗活性，发酵液稀释5 倍后对病菌菌丝生长抑制率仍高达76%。通过形态特征、生理生化、16S rDNA 分子鉴定等方法，发现No.2 菌株具有典型的链霉菌属特征，初步确定为绛红褐链霉菌（Streptomyces purpeofuscus）。目前，还未发现有将绛红褐链霉菌用于黄瓜疫病防治方面的报道，表明No.2 是一株新发现的对黄瓜疫霉菌具有较好防效的放线菌株。作为应用到生产中最早的生防菌[24]，放线菌及其代谢产物已经成为农药研发的新主体之一[25]。目前，拮抗菌No.2还只进行了发酵液的一些抑菌试验及生理生化特性的试验，要应用到生产及新农药的研发中还需进一步研究。

[1]何春玉.高原黄瓜疫病的发生及防治措施[J].北方园艺，2007，（11）：196-196.

[2]林兴祖，冯健敏.海南冬种黄瓜疫病的发生及其防治[J].植物医生，2008，（6）：13-14.

[3]沙锦文，王学平，杨玉洁，等.沿江地区春季黄瓜疫病的发生与防治[J].上海蔬菜，2005，（2）：51-52.

[4]田东蓉，胡小朋.黄瓜疫病的发生与综合防治[J].北方园艺，2008，（8）：204-204.

[5]杨泓威，易图永，雷 颖，等.丁子香酚对黄瓜疫霉菌的室内毒力测定[J].湖南农业科学，2012，（3）：68-70.

[6]CabaasR，Castellá G，AbarcaM L，etal.Thiabendazole resistanceand mutations in theβ-tubulin gene of Penicillium expansum strains isolated from apples and pears with blue mold decay[J].FEMS Microbiology Letters，2009，297（2）：189-195.

[7]Banno S，Fukumori F，Ichiishi A，et al.Genotyping of benzimidazoleresistant and dicarboximide-resistant mutations in Botrytis cinerea using real-time polymerase chain reaction assays[J].Phytopathology，2008，98（4）：397-404.

[8]潘朝勃，李其利，莫贱友，等.杧果炭疽菌拮抗细菌的筛选鉴定及其防病效果[J].植物保护学报，2013，40（006）：517-522.

[9]高小宁，陈金艳，黄丽丽，等.油菜菌核病内生拮抗细菌的筛选及防病作用研究[J].农药学学报，2010，（2）：161-167.

[10]于 婷，尚玉珂，李艳芳，等.短小芽孢杆菌BSH-4抗菌物质的提取及其特性[J].植物保护学报，2009，（1）：65-69.

[11]史 册，韩 梅，张一鸣，等.人参病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定[J].生物技术通报，2014，（9）：102-108.

[12]Demain A L，SanchezS.Microbialdrugdiscovery：80 yearsofprogress[J].The JournalofAntibiotics，2009，62（1）：5-16.

[13]周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版，1986：208-210.

[14]方中达.植病研究方法（第三版）[M].北京：中国农业出版社，1998：243-245.

[15]周棱波，黎定军，陈 武，等.烟草赤星病拮抗菌的筛选[J].湖南农业科学，2011，（7）：100-101.

[16]易图永，高必达，何 昆，等.水稻纹枯病菌生防细菌的筛选[J].湖南农业大学学报，2000，26（2）：116-118.

[17]Zhou T，Chen D，Li C，et al.Isolation and characterization of Pseudomonas brassicacearum J12 as an antagonist against Ralstonia solanacearum and identification of its antimicrobial components[J].MicrobiologicalResearch，2012，167（7）：388-394.

[18]黎志坤，朱红惠.一株番茄青枯病生防菌的鉴定与防病定殖能力[J].微生物学报，2010，（3）：342-349.

[19]Tan S，Jiang Y，Song S，et al.Two Bacillus amyloliquefaciens strains isolated using the competitive tomato root enrichmentmethod and their effects on suppressing Ralstonia solanacearum and promoting tomato plantgrowth[J].Crop Protection，2013，43：134-140.

[20]Tan H，Zhou S，Deng Z，et al.Ribosomal-sequence-directed selection for endophytic streptomycete strains antagonistic to Ralstonia solanacearum to control tomato bacterial wilt[J].Biological Control，2011，59（2）：245-254.

[21]K berl M，Ramadan E M，Adam M，et al.Bacillus and Streptomyces were selected as broad-spectrum antagonists against soilborne pathogens from arid areas in Egypt[J].FEMSMicrobiology Letters，2013，342（2）：168-178.

[22]张 涛.黄瓜疫霉菌生防菌的筛选与培养基优化[D].长沙：湖南农业大学，2012.

[23]伍善东，刘冬华，郭照辉，等.黄瓜疫病菌拮抗细菌的分离及鉴定[J].安徽农业科学，2014，42（20）：6692-6693.

[24]熊仕俊，孙成龙，施 闯，等.番茄青枯病菌拮抗放线菌的筛选及鉴定[J].北方园艺，2014，（5）：114-117.

[25]Thumar JT，Dhulia K，Singh SP.Isolation and partialpurification ofan antimicrobial agent from halotolerant alkaliphilic Streptomyces aburaviensis strain Kut-8[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（11）：2081-2087.