邓恩桉不同成熟度组织中rboh基因表达分析

彭丽君，温小芳，黄真池

（1. 岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江524048；2. 岭南师范学院应用生物技术研究所，广东 湛江524048；3. 岭南师范学院资源植物工程中心，广东 湛江524048）

邓恩桉（Eucalyptus dunnii Maiden）是桉树属－双蒴盖亚属（subgenus symphyomyrtus）－蓝桉组（section Maidenaria）－多枝桉系（series Vim inales）中的速生树种之一[1]，其木材是良好的纸浆材来源。邓恩桉幼树相对其他树种比较耐寒[2]，因此是培养耐寒桉树的优选品种。在我国较冷地区推广邓恩桉，不仅有巨大的经济价值，还能为绿化、增施防护林、增加木材产量等作出贡献。

rboh 基因的表达产物为NADPH 氧化酶，又称呼吸爆发氧化酶同源蛋白（respiratory burst oxidase homolog，rboh），是一类以细胞质中的NADPH 为电子供体，将氧催化生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）的氧化酶[3]。植物在正常生理代谢过程中会产生活性氧，这些活性氧一方面可能会对植物自身造成氧化伤害[4]，另一方面也可能作为信号分子参与细胞周期调控、程序性死亡、激素信号、生物和非生物胁迫反应及生长发育等生命活动的调节[5-7]。已有试验表明，rboh 基因在拟南芥[8]、烟草[9-10]、马铃薯[11]、水稻[12]及玉米[13]的抗病、抗水分等抗胁迫反应中发挥了重要功能。在桉树中，rboh 基因的表达活性与冷胁迫及抗寒机制有着密切联系[14]。研究检测了邓恩桉不同成熟度组织rboh 基因的表达量，探讨了其与邓恩桉生长分化的联系，以期为培育耐寒桉树提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

半年生邓恩桉树苗（Eucalyptus dunnii Maiden），由湖南森林植物园提供。

1.2 材料的培养与处理

剪取邓恩桉嫩茎，先用清水冲洗表面灰尘，再用75%酒精表面消毒45 s，然后用20%次氯酸钠消毒两次，每次7 m in，最后用无菌水淋洗干净。将嫩茎切成1 cm 左右的茎段，接种到添加了0.86 μmol/L N-苯基-N- 噻唑基脲（PBU） 和0.57 μmol/L 吲哚乙酸（IAA）的SPCa 培养基中。先暗处培养2 周，再转移至16 h 光照/8 h 黑暗、50 μmol/m2·s 光强、25±2℃培养箱中继续培养4 周。

1.3 PCR 分析

1.3.1 总RNA 的提取和反转录 用手术刀分别取20 mg 邓恩桉的成熟叶、不定芽和嫩茎于研钵中研磨。先用1 m l RNAiso-mater for Plant Tissue 处理，再按RNAiso Plua 试剂的操作手册提取总RNA，溶于30 μL RNAase-free H2O。在10 μL 反应体系中分别加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL 和总RNA 1 μg，用RNAase-free H2O 补齐至10 μL 后瞬间离心混匀，30℃反应5 min 以去除总RNA 中残存的基因组DNA。再在上述反应体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme M ix I 1 μL、RT Prime M ix 1 μL 和RNAase-free H2O 4 μL，瞬间离心混匀，37℃反应15 m in，85℃5 S 使酶失活，所得产物为cDNA。上述所用试剂均为宝生生物工程（大连）有限公司产品。

1.3.2 目的基因选择及引物设计 根据ThePeroxiBase数据库中巨桉过氧化物酶基因的序列，用primer3 plus软件设计qPCR 引物。经qPCR 预试验筛选出3个扩增效率高、特异性好的rboh 基因作为目的基因。根据黄真池等[15]的研究，选择RTEF 基因作为内参基因。目的基因编号、引物序列及内参基因引物序列见表1。

表1 3种NADPH 氧化酶基因的编号和引物序列及内参基因的引物序列

1.3.3 qPCR 分析rboh 基因 qPCR 反应仪器为Chromo 4TMSystem（Bio-Rad）。以cDNA 溶液进行qPCR。25 μL 反应体系中，添加2 μL cDNA 溶液作模板，每个反应3 次重复。qPCR 程序为：变性94℃9 s，退火58℃9 s，延伸72℃15 s。40个循环后，分析PCR产物的特异性。用Opticon Monitor 3.1 软件分析各基因的扩增效率、Ct 值。设嫩茎的基因表达量为1，用相对定量的Pfaff1 方法计算各基因的相对表达值。

2 结果与分析

2.1 不定芽的诱导

嫩茎切段接种在SPCa 培养基中，15 d 后不定芽直接从芽原基处长出，呈浅绿色（图1）。50 d 后，不定芽变得较为粗壮，苗茎伸展，叶子大而舒展。

图1 邓恩桉萌发的不定芽

2.2 总RNA 的提取

桉树组织中多糖、酚类等物质含量丰富，严重干扰了RNA 的提取。经RNAiso-mate for Plant Tissue 预处理，再用RNAiso Plus 抽提，均可从邓恩桉不定芽、嫩茎和成熟叶中提取出高质量的RNA。经NanoDrop 2000c 紫外分光光度法检测，样品OD260/OD280为1.9～2.05。琼脂糖凝胶电泳结果显示，总RNA 条带清楚、完整，无明显降解，且无可见的DNA 污染（图2）。

2.3 rboh 基因和内参基因的扩增特异性分析

图2 3种邓恩桉组织总RNA 的琼脂糖凝胶电泳结果

由图3 可知，rboh 基因和内参基因的融链曲线均只有1个特征峰值，RTEF、rboh2、rboh3 和rboh4 基因的融链温度分别为82、86、85、82℃，说明qPCR 扩增特异性好。

图3 rboh 基因和RTEF 基因qPCR 融链温度

2.4 rboh 基因表达

设嫩茎的基因表达量为1，qPCR 检测得到了邓恩桉3种不同成熟度组织中rboh2、rboh3 和rboh4 的相对定量表达结果（图4）。这3个基因在成熟叶组织中的表达量最高，嫩茎次之，不定芽的表达量最低。其中成熟叶中的rboh2 基因的表达量约为不定芽中的5倍，成熟叶中rboh4 基因的表达量约为不定芽中的3倍。3个rboh 基因在不同成熟度组织中的转录水平由强到弱依次为成熟叶>嫩茎>不定芽。

图4 邓恩桉不定芽和成熟叶相对于嫩茎中的rboh 基因转录水平

3 结论与讨论

活性氧作为植物的代谢中间产物，不仅影响植物各器官（根、茎、叶、花、果实、种子）的生长发育[16]，并且与其他信号分子如水杨酸[17-20]、NO[17,21]等共同调节植物的各种生理活动。实验证明，NADPH 氧化酶是植物细胞活性氧产生的主要酶类之一[22-27]，即rboh 基因是调节植物各种生理活动的关键基因。影响rboh 基因表达的因素有很多，水分胁迫、重金属胁迫、盐胁迫、高低温胁迫等都能影响和调节rboh 基因的表达和ROS 的积累[28]。试验表明，在适宜的生长条件下，随着植物生长发育程度的不同，rboh 基因的表达量也会有所差异，即邓恩桉rboh 基因的表达受组织分化程度的影响。

桉树的抗寒机制相当复杂，不仅受过氧化物的影响，还受原生质膜透性、膜脂成分、保护酶以及可溶性物质等的影响[29]。rboh 基因在邓恩桉抗寒代谢中是如何起作用的，其是否对邓恩桉抗寒代谢起关键作用，这些问题有待于进一步开展遗传转化方面的研究。

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