不同浓度的血清素对体外培养大鼠成骨细胞分化的影响

刘海波，孙海飚，韩晓强，卢向东，韩树峰，王彤

1. 山西医科大学第一临床医学院，太原 030001

2. 山西医科大学第一医院 骨科，太原 030001

3. 山西医科大学公共卫生学院，太原 030001

*论著——老龄与康复医学*

不同浓度的血清素对体外培养大鼠成骨细胞分化的影响

刘海波1，孙海飚2，韩晓强2，卢向东2，韩树峰2，王彤3

1. 山西医科大学第一临床医学院，太原 030001

2. 山西医科大学第一医院 骨科，太原 030001

3. 山西医科大学公共卫生学院，太原 030001

目的：研究不同浓度的血清素对体外培养大鼠成骨细胞分化的影响。方法：分离培养新生SD大鼠颅骨的成骨细胞，分别向培养液中加入不同浓度的血清素，分为4组：0 mol/L组（空白对照组）、10-9 mol/L组、10-8 mol/L组、10-7 mol/L组，通过RT-PCR检测骨钙素（OCN），碱性磷酸酶（ ALP），Runt相关转录因子-2（Runx 2）和Osterix mRNA相对表达量的变化。结果：不同浓度的血清素均可以抑制骨钙素（OCN），碱性磷酸酶（ ALP），Runt相关转录因子-2（Runx 2）和Osterix mRNA的相对表达量，且这种抑制作用随着血清素浓度的增大而增强。结论：血清素可以剂量依赖性地抑制成骨细胞的分化，这为骨质疏松症的治疗提供了新的思路。

血清素；成骨细胞；分化

骨质疏松症（Osteoporosis， OP）是一种由各种原因引起的全身性疾病，其特点是骨量减少、骨组织微结构破坏和骨骼脆性增加，从而使人体容易发生骨折［1］。目前研究表明，骨质疏松症的发生主要与骨代谢的异常有关，即破骨细胞生命周期延长和成骨细胞生命周期缩短导致骨代谢失衡、正常骨量减少［2］。而血清素是一种古老的神经递质，其化学结构为五-羟色胺（5-TH），广泛表达于中枢神经系统、周围神经系统等全身各组织［3］，且有研究表明其可以调节骨形成和骨吸收过程，这对正常骨量的保持显得尤为重要［4］，可能与骨质疏松症的发生发展有着密切的关系。目前血清素对体外成骨细胞的影响研究甚少，所以本实验是研究对原代培养的大鼠成骨细胞施加不同浓度的血清素，并通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨钙素（osteocalcin，OCN），碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase， ALP），Runt相关转录因子-2（runt-related transcription factor2 ，Runx2）和Osterix 的mRNA相对表达量来探讨不同浓度的血清素对体外培养成骨细胞分化的影响，为骨质疏松症的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

超净工作台（BoXun公司，中国）；CO2培养箱（Forma 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；RNA逆转率仪及PCR扩增仪（Bio-Rad公司，美国）；DMEM-F12培养液（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青，中国）；Trizol试剂（大连Takara 公司，中国）；Primescript RT Master Mix 及PCR扩增试剂（大连Takara 公司，中国）；质量百分比为0.25%的胰蛋白酶、质量百分比为0.1%的Ⅱ型胶原酶、血清素（Sigma公司，美国）；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.2 实验动物

24h内新生SD大鼠（山西医科大学动物实验中心），雌雄及体重不限。

1.3 新生大鼠颅骨成骨细胞的分离培养和鉴定

将出生24h以内的SD大鼠断颈处死，无菌条件下取新生SD大鼠颅骨，用PBS（含100U/ml青霉素 100U/ ml 链霉素 ）的培养皿中。加入0.25%胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶消化后，离心过滤接种于培养瓶中，置于CO2培养箱（37℃，5% CO2）中培养。原代OBs第3天在倒置显微镜下拍照观察，并通过BCI/NBT试剂盒定性检测ALP，方法为细胞用体积百分比为95%乙醇固定15 min，洗涤3次，加入适量染色工作液室温避光孵育30 min。

1.4 实验分组

对体外分离培养的成骨细胞每3 d换液1次，待融合达到约90%时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。用葡萄糖被覆活性炭处理以去除培养血清中含有的血清素。根据培养基中加入血清素浓度不同将细胞分为4组：0mol/L组（空白对照组）、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组。选取第3代成骨细胞，待其完全贴壁后换成含不同浓度血清素的完全培养基进行培养。

实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测OCN，ALP， Runx2和Osterix mRNA的相对表达量。

在培养的第10天，分别对上述各组成骨细胞加入Trizol试剂提取总RNA，后按37℃反转录反应15 min，85℃反转录酶的失活反应5s，后4℃1h，逆转录得到cDNA。用RT-PCR检测OCN，ALP，Runx2和Osterix mRNA mRNA的相对表达量（引物序列见表1）。RTPCR的反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，退火30s，共40个循环；溶解曲线95℃ 60s，55℃30s，95℃30s，1个循环。以β-actin作为内参来估计初始拷贝数，反应的特异性通过溶解曲线来分析，用2-△△Ct法来计算相关基因的相对表达量。

1.5 统计分析

以上实验均重复3次，所得的实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（± s）表示，组间比较采用单因素方差分析，各组两两比较采用SNK法，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1 成骨细胞形态学观察及鉴定

倒置显微镜下观察，原代培养第3天的大鼠成骨细胞呈三角形、多边形、长梭形，胞浆丰富，胞核较圆，轮廓清晰（见图1）。ALP 定性染色对其进行鉴定，可见成骨细胞胞浆蓝染，呈阳性（见图2）。

图1 显微镜下第三代大鼠成骨细胞形态（100×）

图2 对大鼠成骨进行ALP免疫组化染色（200×）

2.2 血清素抑制成骨细胞分化

2.2.1血清素抑制成骨细胞OCN和ALP mRNA的相对表达量

ALP和OCN分别是成骨细胞早期分化和晚期的分化标志，本研究结果显示：空白对照组（0mol/L组）、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组OCN mRNA的相对表达量分别为1.01±0.06、0.79±0.08、0.61±0.05、0.36±0.06，呈剂量依赖性降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；各组ALP mRNA的相对表达量分别为0.98±0.05、0.76±0.09、0.62±0.07、0.38±0.06，呈剂量依赖性降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）（见表2）。

2.2.2血清素亦能抑制成骨细胞Runx2和Osterix mRNA的相对表达量

Runx2和Osterix是成骨细胞形成的重要转录因子，本研究结果显示：空白对照组（0mol/L组）、10-9mol/ L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组Runx2 mRNA的相对表达量分别为0.99±0.06、0.73±0.06、0.61±0.03、0.46±0.07，呈剂量依赖性降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；各组Osterix mRNA的相对表达量分别为0.95±0.09、0.80±0.04、0.67±0.04、0.51±0.08，呈剂量依赖性降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01（）见表2）。

表2 不同浓度血清素对OCN，ALP，Runx2和Osterix mRNA的相对表达量的影响（2）（n=3， ± s）-△△Ct

3 讨论

骨代谢主要包括骨形成和骨吸收，即成过程与破骨过程，这两个过程的平衡是维持正常骨量的关键。而成骨细胞和破骨细胞是骨代谢中成骨过程与破骨过程中的重要功能细胞，其中破骨细胞的作用是骨的吸收。而主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质干细胞分化而来的成骨细胞，能特异性分泌多种生物活性物质，进而调节并影响骨的形成和重建过程。在不同成熟时期，成骨细胞在体内表现为4种不同形态，即前成骨细胞、成骨细胞、骨细胞和队形细胞。其中，成骨细胞富含ALP和 OCN，二者分别是成骨细胞早期分化和晚期的分化标志［5］。而Runx2作为成骨细胞分化的重要调节因子［6-8］，在成骨细胞的诱导、复制和成熟的整个过程中发挥着重要的作用，许多影响成骨细胞分化的信号通路和转录因子都是通过影响 Runx2 的产生和活化来发挥作用的。另外，Osterix是表达在成骨细胞上的锌指转录因子，在成骨细胞的形成过程中也发挥着重要的作用［9］。研究表明，在Osterix 基因敲除小鼠胚胎中，Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞分化的标志物的表达水平严重降低。

血清素作为一种古老的神经递质其广泛表达于全身各组织，并且发挥着重要而复杂的生理作用。本研究发现，不同浓度的血清素均可抑制成骨细胞分化的标志物ALP和OCN以及成骨细胞分化的转录因子Runx2 和Osterix的表达，且呈剂量依赖性。这与代守前等［5］的研究结果一致，即血清素可以抑制成骨细胞分化，且这可能与血清素激活了不同亚型的血清素受体（如HTlA、5-HTlB、 5-HTlD、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2）有关。Yadav等［10］的研究也得出了相似的结论，即血清素可以抑制成骨细胞分化进而抑制骨形成，且这种作用是通过依赖低密度脂蛋白受体相关蛋白-5（low density lipoprotein receptorrelated protein 5，Lrp-5）的途径实现的。

而有些研究却得出了相反的结论。Collet 等［11］等构建了敲除5-HT2B受体的基因工程小鼠研究发现，敲除5-HT2B受体基因以后，小鼠的骨密度明显降低。这说明血清素通过5-HT2B受体可以促进成骨细胞分化，进而促进骨形成。笔者认为，造成这种差异的原因可能是：血清素通过各种不同的信号通路调控成骨细胞的分化，进而促进或者抑制骨的形成。而各实验研究由于实验条件、实验方法及实验研究侧重点等方面的不同导致了在不同研究中不同的信号通路占优，所以会得出不同的结论。

综上，本研究通过体外培养大鼠颅骨的成骨细胞，并对其施加不同浓度的血清素研究发现，不同浓度的血清素呈剂量依赖性抑制成骨细胞的分化，进而抑制骨的形成，为血清素作为骨质疏松症治疗的新靶点提供了新的依据。在将来随着对其作用机制的进一步研究和生物科学技术的发展，对血清素的有效调控可能会成为骨质疏松症的新的方法。

4 结论

血清素可以剂量依赖性地抑制成骨细胞的分化，这为骨质疏松症的治疗提供了新的思路。

（References）

［1］ 王宁，刘玉杰.骨质疏松的发病机制与危险因素［J］.中国骨质疏松杂志， 2013， 19（5）：537-540.

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［3］ 代守前，余利鹏，韦永中，等.肠源性血清素对骨代谢的影响［J］.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2012，5（3）：214-218.

［4］ Ducy P.5-HT and bone biology ［J］. Curt Opin Pharmaeol ，2011，11（4）：34 -38.

［5］ 代守前，施秀，韦永中，等.血清素对体外培养大鼠出骨细胞增殖分化和矿化功能的影响［J］.中华创伤骨科杂志，2013，15（9）：784-789.

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［10］ Yadav VK1， Ryu JH， Suda N， et al. Lrp5 controls bone formation by inhibiting serotonin synthesis in the duodenum［J］. Cell，2008，135（5）：825-837.

［11］ Collet C，Sehihz C，Geoffrey V，et a1.The serotonin 5-HT2B receptor ontrols bone mass via osteoblast recruitment and proliferation［J］.FASEBJ，2008，22（2）：418-427.

The effects of serotonin at different concentrations on differentiation of cultured primary rat osteoblasts in vitro

LIU Haibo1， SUN Haibiao2， HAN Xiaoqiang2， LU Xiangdong2， HAN Shufeng2， WANG Tong3
1. The First Clinical Medical College， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001
2. Department of Orthopedics， the First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001
3. Department of Public Health， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001

Objective： to study the effects of serotonin at different concentrations on differentiation and of cultured primary rat osteoblasts in vitro. Methods： the osteoblasts from the skull of newborn SD rats， were divied into four groups by the culture medium with different serotonin concentrations： 0mol/L group（blank control）， 10-9mol/L group， 10-8mol/Lgroup and 10-7mol/L group. In addition， mRNA expression of osteocalcin（OCN）， alkaline phosphatase（ALP）， runt-related transcription factor2 （Runx2） and Osterix were quantitated by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Results： different concentrations of serotonin inhibited the mRNA expression of OCN， ALP， Runx2and Osterix of osteoblasts； And， the inhibitory effect of serotonin was dose-dependent. Conclusion：serotonin can inhibit differentiation of osteoblasts； which provide a novel approach for the treatments of osteoporosis.

serotonin； osteoblasts； differentiation

R681

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.07

2015-05-06 ；

2015-07-12

山西省自然科学基金（2013011057-3）

刘海波，硕士研究生，研究方向为血清素对骨质疏松症影响的基础研究，电子信箱：86578031@qq.com；韩树峰（通信作 者），教授，研究方向为骨质疏松和脊柱外科，电子信箱：drhanshufeng@sohu.com；王彤（通信作者），教授，研究方向为多元统计方法，电子信箱：wtstat@21cn.com

引用格式：刘海波，孙海飚，韩晓强，等.基于Hadoop的医学影像数据平台应用研究［J］.世界复合医学，2015，1（3）：227-230