基于HPLC/ESI-MS技术的川乌加热前后化学成分变化△

林宏英，苏畅，段天璇，黄建梅，孙毅坤，王玥，冀娇娇，董洁，刘永刚*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.北京鑫康辰医学科技发展有限公司，北京 100048)

·基础研究·

基于HPLC/ESI-MS技术的川乌加热前后化学成分变化△

林宏英1，苏畅2，段天璇1，黄建梅1，孙毅坤1，王玥1，冀娇娇1，董洁1，刘永刚1*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.北京鑫康辰医学科技发展有限公司，北京 100048)

目的：研究川乌在加热前后生物碱变化。方法：采用LC-MS测定方法，Agilent Zorbax Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；流动相为醋酸铵(氨水调pH 8)-乙腈(20 mmol·L-1)；流速为1.0 mL·min-1；质谱采用正离子检测模式。结果：分析鉴定了川乌中13个生物碱类成分，其中9个生物碱在加热过程中的变化较明显。结论：本方法简便，具有较高的准确度和精密度，可用于生物碱变化的分析。

川乌；液质联用；成分变化

川乌为常用中药，是毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，主产于四川江油、平武、绵阳，陕西城固、户县、南郑等地。具有回阳救逆、温中补肾、散寒止痛等功能，用于风寒湿痹，关节及筋骨疼痛，头风疼痛，半身不遂，寒疝腹痛，阴疽肿毒等证[1]。从汉代张仲景的《金匮要略》出现乌头的炮制方法起，演变至今已有约70多种炮制方法，主要有盐炙川乌、酒炙川乌和川乌炭等。一直以来，对川乌的炮制研究主要集中在乌头碱等3种双酯型生物碱的变化上[2-6]，由于方法的限制，所得到的信息不够全面，具有一定的局限性。本试验采用HPLC/ESI-MS技术对川乌加热不同时间的化学成分进行了全面的研究，阐明了川乌经炮制后化学成分的量变和质变。该方法灵敏度高，结果准确可靠，为中药材的炮制研究提供了新思路和新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱-电喷雾离子源-串联三重四极杆质谱联用仪(HPLC-ESI-MS，美国Thermo Fisher公司)；电子天平(BSA124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；pH计(PHS-W系列，上海般特仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ32OO型，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

乌头碱对照品、新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、苯甲酰乌头碱对照品、苯甲酰新乌头碱对照品、苯甲酰次乌头碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110720-201111，110798-201106，110799-201106，111794-201102，111795-201002，111796-201002)；乙腈(色谱纯，美国MREDA TECHNOLOGY INC)；醋酸铵(分析纯，Sigma-Aldrich公司)；氨水(分析纯，北化精细化工有限公司)；水为纯净水(杭州娃哈哈集团公司)；川乌药材(四川江油中坝附子科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱6种对照品适量，加甲醇溶解，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取生川乌药材粉碎，精密称取10 g，2份，分别置于500 mL的烧瓶中，各加水500 mL。其中1份加热回流提取，保持微沸，分别于10、30、60、90、120、150、180 min取样，每次取1 mL，再加1 mL水补足减失的重量。色谱图见图1。

A.加热10 min；B.加热30 min；C.加热60 min；D.加热90 min；E.加热120 min；F.加热150 min；G.加热180 min。图1 加热不同时间的总离子流色谱图

2.3 分析条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸铵(pH=8)，梯度洗脱：0～40 min，15%～30%乙腈，40～70 min，30%～60%乙腈；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1。

2.3.2 质谱条件 正离子检测模式。喷雾电压(Spray Voltage)为3000 V；离子传输管温度为350 ℃；蒸发器温度(Vaporizer Temperature)为250 ℃；鞘气压力(Sheath Gas Pressure)为30 arb；辅助气压力(Aux Gas Pressure)为10 arb；采用全扫描(Full Scan)、二级全扫描(MS2)，全扫描质量范围(m/z)为100～1200；MS2碰撞气为氩气；分流进样，分流比为4∶1。

3 结果

3.1 生物碱的鉴定

准分子[M+H]+乌头类生物碱在阳离子模式下很容易检测到[7]，这在本试验中也得到了进一步的证实。通过对LC-MS检测结果的分析，在川乌加热提取中除了双酯型生物碱外，还检测到多种化合物，其准分子离子m/z分别为486、500、470、590、604、572、574、586和556，结合其MS2谱特征离子，推测其对应的化合物分别为中乌头原碱、乌头原碱、次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、焦中乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、焦乌头碱、焦乌头次碱，其中中乌头原碱、乌头原碱、次

乌头原碱、中乌头次碱、乌头次碱和次乌头次碱6个化合物分别为中乌头碱、次乌头碱和乌头碱水解产物。相应的碎片离子见表1。另外，结合参考文献[7]，又鉴定了4个生物碱，分别为去氧次乌头原碱、塔拉胺、Karakolidine和尼奥灵。结合文献[8]报导，推断焦乌头碱、焦乌头次碱和焦中乌头碱为热解产物。

表1 13个化合物的MS2裂解特征

3.2 9个生物碱的含量变化

通过分析不同加热时间不同产物的峰面积，加热时间分别为10、30、60、90、120、150、180 min。9个化合物峰面积发生了明显改变，其变化曲线见图2。

图2 9个化合物峰面积变化的加热曲线图

4 讨论

在化合物液相分离过程中，流动相选择对试验起着关键性的作用。本试验使用的流动相为乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸铵，醋酸铵用氨水调pH至8.0～8.4。流动相PH值对结果影响较大，试验过程中应注意控制PH值。

本试验采用先进的HPLC/ESI-MS技术对川乌加热前后的化学成分进行了全面系统的研究，发现川乌经炮制后不但有已知成分量的变化，而且还有内在成分质的改变。这些炮制后新产生的组分以及发生量变的组分极有可能是川乌炮制后功能改变的物质基础，但是仅靠质谱分析并不能确定这些未知物质的准确结构，需要借助其他手段做进一步研究。

川乌炮制后化学成分质量分数有的增加，有的减少，很可能是某些成分在炮制过程中发生了化学反应，转化成了其他的成分。在试验过程中笔者发现，随着炮制时间延长，乌头碱等双酯碱质量分数逐渐减少，而单酯型生物碱质量分数逐渐增加，到一定时间后逐渐减少，焦乌头碱也呈现此规律。因此，推测乌头碱在加热过程中发生了两种反应，一种是水解过程，由于酯水解过程需要水的参与；而生成焦乌头碱的过程中不需要水的参与，故推测为热解反应。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：36-37.

[2] 王勇，刘淑莹.乌头碱类生物碱的质谱研究进展[J].质谱学报，2002，23(2)：112-119.

[3] 李正邦，吕光华，陈东林，等.草乌中生物碱的化学研究[J].天然产物研究与开发，1997，9(1)：91.

[4] 符华林.我国乌头属药用植物的研究概况[J].中药材，2004，27(2)：149-152.

[5] 高黎明，郑尚珍，沈序维，等.乌头属植物中二萜生物碱研究进展[J].西北师范大学学报，1999，35(2)：109-116.

[6] 王本祥.现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997.

[7] Hu R，Zhao J，Qi L W，et al.Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23(11)：1619-1635.

[8] 王峰峰，宋兆辉，张兰兰，等.乌头碱、新乌头碱、次乌头碱水解和醇解产物的研究[J].中国中药杂志，2012，37(11)：1564-1569.

中国植物学会第十三届全国药用植物及植物药学术研讨会

暨2015年海峡两岸中医药科学交流会

第一轮通知

为了进一步促进我国药用植物研究的深入，推动中医药事业的发展，中国植物学会第十三届全国药用植物及植物药学术研讨会暨2015年海峡两岸中医药科学交流会拟于2015年7月中旬在世界文化与自然双重遗产、世界生物圈保护区，国家级自然保护区武夷山举行。本次会议由中国植物学会药用植物及植物药专业委员会主办，福建农林大学生命科学学院承办，福建生物工程职业技术学院，三明市农科院药用植物研究所等单位协办。会议主题“药用植物与中药现代化”。大会将邀请国内相关领域院士和知名专家学者就国内外药用植物与中药现代化方面研究的发展趋势、最新进展及热点领域、热点问题等作学术报告，同时邀请多名台湾地区该领域的知名学者作大会报告，促进海峡两岸的交流与合作。热诚欢迎全国药用植物及植物药同仁踊跃参加本次学术盛会。

详情浏览《中国现代中药》官方网站(http://www.zgxdzy.net/ch/reader/view_news.aspx?id=20150318090129001)

ChangesofChemicalConstituentsinRadixAconitiPreparatabeforeandafterHeatingBasedonHPLC/ESI-MS

LINHongying1，SUChang2，DUANTianxuan1，HUANGJianmei1，SUNYikun1，WANGYue1，JIJiaojiao1，DONGJie1，LIUYonggang1*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.BeijingXKCMedi&TechDevelopeCo.，Ltd.，Beijing100048，China)

Objective：To analyze the changes of chemical constituents inRadixAconitiPreparata before and after heating.Methods：The different extract ofRadixAconitiPreparata were detected by using HPLC/ESI-MS.Results：The constituents with significant differences before and after heating were identified.The results showed that a total of 13 chemical constituents were identified and nine constituents were significantly different before and after heating.Conclusion：The HPLC/ESI-MS method is proved to have a high sensitivity and the result is accurate and reliable.The method could reflect the changes of multiple chemical constituents of Chinese materia medica in the course of processing.

RadixAconitiPreparata；HPLC/ESI-MS；chemical constituents

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.005

2014-10-01)

北京中医药大学自主选题项目(2013-JYBZZ-JS-039)

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刘永刚，副教授，硕士生导师，研究方向：中药物质基础研究；Email：liuyg0228@163.com