仁栝楼一步成苗离体快繁技术△

荣俊明，韩琳娜，郭庆梅

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

·中药农业·

仁栝楼一步成苗离体快繁技术△

荣俊明，韩琳娜*，郭庆梅*

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

目的：为解决仁栝楼种苗的大量需求及繁育繁琐问题。方法：利用仁栝楼的腋芽作为外植体，进行一步成苗离体培养。结果：筛选出最佳一步成苗培养基为 MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，植株再生频率达 5.4。壮苗后的仁栝楼组织培养苗可直接移栽到育苗基质中，成活率可达77.1%。结论：仁栝楼一步成苗离体培养技术大大缩短了育苗周期。

仁栝楼；组织培养；一步成苗

栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim，为葫芦科多年生草质藤本植物，其根(中药名天花粉)、种子(中药名栝楼仁)、果实(中药名栝楼实)、果皮(中药名栝楼皮)均可入药，有润肺祛痰、滑肠散结的功能[1-2]。特别是天花粉目前已被用于引产，治疗葡萄胎、恶性葡萄胎和宫外孕[3]。仁栝楼是山东栽培栝楼的优良农家品种，也是GAP研究的首选品种[4]。因为仁栝楼用途广，目前种植方法得到的产量已经满足不了市场日益增长的需求，鉴于栝楼繁育困难，可借助组织培养技术来解决此问题[5]。通过愈伤组织得到再生植株的组培技术，前人已经做了大量研究，但对仁栝楼组培快繁一步成苗技术尚未见报道。本研究应用植物组织培养技术，通过筛选不同激素组合诱导仁栝楼一步成苗的最佳培养基，探索出不经过愈伤组织这一环节的一步成苗快速繁殖培养方法，可以大大缩短组培时间，节省成本，提高成活率，尽快解决现在市场对种苗的需求。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验用仁栝楼来源于山东中医药大学药圃，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)，5月初从长势良好的植株上取当年生的嫩腋芽做外植体。

1.2 培养方法

1.2.1 无菌外植体的获得 外植体准备：剪取2 cm左右的栝楼嫩腋芽用2% 餐洗净洗去灰尘后流水冲洗10 min，置于超净工作台上。75%乙醇浸泡外植体1 min，无菌水冲洗；0.1% 升汞(含吐温-20)消毒3 min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分，备用。

1.2.2 一次性成苗培养基的确定 以MS为基本培养基，分别附加 6-BA 0.1、0.2、0.5 mg·L-13个水平，NAA0.1、0.2 mg·L-12个浓度水平进行试验，共组成6种诱导培养基，每种培养基平行5瓶，每个三角瓶接种3个外植体，观测并统计每种培养诱导外植体一次成苗的结果，确定一步成苗培养基最适配方。

1.2.3 培养条件 外植体常规消毒后，接种于100 mL三角瓶内，置于人工气候箱中培养。培养条件：pH 5.8，琼脂浓度0.7%，蔗糖含量3%，培养温度25±1 ℃，光照强度2500 Lx，光照时间12 h·d-1。

1.2.4 结果统计 对接种后植株观察其愈伤组织形态学变化。在接种后20 d观察叶片大小、叶色、生长速度，测量试管苗高度。接种后 60 d统计再生植株频率、根长度和主根数量，再生植株频率=再生植株总数/接种的外植体数[6]。

2 结果和分析

2.1 愈伤组织形态学观察

在培养过程中，无论能否诱导愈伤组织，叶片均能保持一段时间鲜绿。4～5 d 后，能够发生愈伤组织的外植体，与培养基接触的部分向上拱起 。10 d左右外植体边缘开始出现颗粒状膨大，随后瘤状突起向周围扩展，15 d 左右形成明显可见的愈伤组织，颜色为浅黄色。此时，仍有一些外植体，虽然仍是绿色，却不能形成愈伤组织。20 d 左右，愈伤组织进一步膨大，表面粗糙如蘑菇云状(图1)。愈伤组织的颜色逐渐变深，说明15～20 d，为愈伤组织生长旺盛时期，最宜进行愈伤组织的继代培养。若不转移培养基，35 d左右愈伤组织块底部长出白色绒毛细根，50 d左右形成根叶完整的一体苗 。

2.2 不同激素和浓度配比对仁栝楼一步成苗的影响

将仁栝楼嫩芽外植体接种在含 6种激素的 MS 培养基上，其一步成苗的结果见表1。6-BA浓度较高的 2号、4号和6号培养基叶片较小，颜色较浅，生长缓慢且较矮小。而1号、3号和5号培养基叶片较大，颜色较深，生长较快并且长势较高，尤其5号培养基植株长势最好(图2、3)。

表1 不同培养基对仁栝楼再生苗的影响 (n=15)

图1 4号培养基接种20 d生长情况

图2 5号培养基接种60 d生长情况

图3 1号培养基接种60 d生长情况

2.3 不同激素浓度对仁栝楼再生和生根情况的影响

接种后30 d时，栝楼试管苗开始长出大量的白根，同时成长的茁壮的植株速度减慢。1号、2号、6号主根个数较少，生长缓慢，随着NAA浓度增加和6-BA浓度减小，3号、4号、5号培养基的根个数增多，并且生长速度快长势较好(图4，图5)。5号培养基其地上部和根部均有旺盛的长势，且植株再生频率高。接种后60 d栝楼苗的生长情况统计结果见表1。通过对比认为，6种培养基中，以5号培养基MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA为仁栝楼最合适的一步成苗培养基。

2.4 炼苗与移栽

当试管苗生长出发达的根系。将试管苗从人工培养箱移至自然条件下，1 d后松开瓶口，3 d后打开瓶盖炼苗，7 d后取出试管苗洗去根部培养基栽入育苗基质中，注意保持一定的湿度。30 d后统计移栽成活率为77.1%。移栽成活后植株如图6。

图4 6号培养基接种30 d根生长情况

图5 5号培养基接种30 d根生长情况

图6 移栽后15 d生长情况

3 讨论

通常栝楼传统生产繁殖靠种子、分株等方法，在很大程度上限制了大面积的推广栽培，进行离体高效快繁可以解决这一问题。通过愈伤组织再分化芽苗途径可以有效的提高增殖系数，但外植体诱导愈伤组织的周期较长、获得不定芽速度较慢、试验次数较多，且愈伤组织长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。因此，相对于愈伤组织再分化芽苗来说，腋芽增殖并同时生根这一途径，不仅成苗速度快，繁殖系数高，而且遗传稳定性强，能在短期内获得大量良种苗，有效解决良种苗匮乏的现状。

在实际的生产过程中，普通快繁需要经过诱导、继代、壮苗和生根四个阶段的培育，且分别使用不同的培养基。如果用一种或两种培养基实现四个阶段的培养，得到移栽苗，既可简化生产程序，提高培养效率，又能缩短育苗周期，降低生产成本。这也是衡量培养基配方是否理想的重要标准。

本研究建立了由腋芽再生完整植株的栝楼一步成苗快速繁殖体系，从接种外植体到试管苗仅需60天，将传统组培快繁技术育苗周期缩短一半。可在短时间内大量繁殖栝楼种苗，为栝楼种植业生产提供优质种苗。且其方法简捷，经济实用，可操作性强。因此可进行推广使用以及工业化生产，达到快速增殖的目的。

致谢：本项目在山东中医药大学大学生创新创业训练平台完成，获得学校2013年度大学生研究训练计划(SRT)项目立项资助，项目编号2013266；韩琳娜博士为本项目指导教师。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1996：244-245.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：104-105.

[3] 姚红丽，仝进毅.天花粉蛋白在妇产科临床应用进展[J].浙江中西医结合，2013，23(11)：954-956.

[4] 郭庆梅，周凤琴，李定格等.瓜蒌的名称、原植物和产地的本草考证[J].中医研究，2006，19(3)：28-29.

[5] 高丽红.栝楼愈伤组织的培养[J].科苑观察，2010，23(05)：27-28.

[6] 曾爱松，宋立晓，高兵等.结球甘蓝小孢子胚植株再生体系的优化[J].江苏农业学报，2013，29(1)：228-230.

In-vitroRegenerationofOneStepSeedlingsforTrichosantheskirilowiiMaxim.

RONGJunming，HANLinna*，GUOQingmei*

(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China)

To solve the problems of breeding and the large demand of seedling ofTrichosantheskirilowii，a fast regeneration system of one step seedlings was established forT.kirilowii.The optimum regeneration medium was MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1and the plant regeneration frequency reached 5.4.The survival rate of seedling transplanting could reach 77.1%.The technology of one-step seedlings forT.kirilowiican shorten the breeding cycle greatly.

TrichosantheskirilowiiMaxim；tissue culture；one-step seedling breeding

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.012

2014-11-26)

山东省科技发展计划2011GSF11094

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韩琳娜，博士，副教授，研究方向为分子生药学，E-mail：linnahan@163.com 郭庆梅，教授，博士，主要从事中药质量控制与资源的研究，E-mail: qmguo@sina.com