响应面法优化草本水杨梅多酚超声辅助提取工艺及抗氧化活性△

张岳，赵岩*，蔡恩博，刘双利，杨鹤，张连学*，王士杰

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业科技学院 中药学院，吉林 132101)

·中药工业·

响应面法优化草本水杨梅多酚超声辅助提取工艺及抗氧化活性△

张岳1，赵岩1*，蔡恩博1，刘双利1，杨鹤1，张连学1*，王士杰2

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业科技学院 中药学院，吉林 132101)

目的：优化草本水杨梅多酚的超声提取工艺，并研究其抗氧化活性。方法：以草本水杨梅为原料，采用超声辅助法提取草本水杨梅多酚，在单因素试验基础上，采用三因素五水平的响应面试验，优化工艺参数。结果：草本水杨梅最佳提取工艺条件为乙醇浓度33.76%，超声提取时间36.94 min，液固比为201.78 mL·g-1，在此条件下草本水杨梅多酚提取率为9.67%；三因素对草本水杨梅多酚提取率影响主次顺序为乙醇浓度>超声提取时间>液固比。并以水溶性VC和BHT为对照物，通过DPPH自由基清除法和总还原力法对草本水杨梅多酚的抗氧化活性进行了体外评价，发现在一定范围内草本水杨梅多酚的清除DPPH自由基能力和总还原能力均随多酚浓度的增加而上升。结论：由响应面法优化得到的草本水杨梅多酚的提取工艺方便可行，得到的草本水杨梅多酚具有较强的抗氧化活性，为草本水杨梅资源的开发与利用奠定了基础。

草本水杨梅；多酚；超声波辅助提取；响应曲面设计；抗氧化性

草本水杨梅别名追风七、老五叶、海棠菜，为蔷薇科水杨梅属植物[1]，主要分布于我国东北、华北、西北等地区[2]，长白山海拔400～1500 m山区分布尤为丰富[3]。民间以其全草或根入药[4]，具有清热解毒、消肿止痛、利尿等功能[5]，临床主要用于治疗肠炎、腰腿疼痛、跌打损伤、小儿惊风、疥疮、痈肿等症[6]。近年大量研究表明，合成抗氧化剂BHA/BHT具致癌作用，而天然抗氧化剂不仅能抗衰老、抗辐射、捕集体内自由基的抗氧化等功能[7-8]，且抗氧化效率高、作用时间长、热稳定性好、清除氧自由基能力强、毒副作用小[9-13]。多酚类物质作为新型天然高效抗氧化剂，也越来越受关注[14]。国内外研究发现，草本水杨梅中含有多酚类物质[15-17]，而对其多酚的提取工艺没有研究，抗氧化活性方面也鲜有报道。笔者建立了草本水杨梅多酚提取数学模型，并对其抗氧化活性进行初步研究，以期为草本水杨梅多酚作为天然抗氧化剂的资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草本水杨梅采自吉林农业大学校园内，经水洗、阴干、粉碎，备用；没食子酸(北京百灵威科技有限公司)；福林酚试剂(合肥博美生物)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、维生素C(Vc)(上海源叶生物科技有限公司)；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(百灵威科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CGT-3.5K超声波清洗器(港威超声电子有限公司)；LD-34流水式中药粉碎机(大海药材器械厂)；百灵LA114型电子天平(百灵天平仪器有限公司)；UV-1800紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；HH-W-600型数显恒温水箱(金坛市江南仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 草本水杨梅多酚类物质的超声辅助提取 精确称取0.10 g草本水杨梅原料粉，放入三角瓶中，加入一定量的提取溶剂，超声波提取多酚类物质，抽滤后密封避光储存，待测。

1.3.2 多酚的测定 采用福林酚比色法测定[18]，移取0.5 mL样品溶液放入25 mL容量瓶中，加入2.5 mL福林酚试剂和2 mL质量浓度为75 g·L-1的碳酸钠(Na2CO3)溶液，50 ℃水浴加热5 min，冷却后用蒸馏水定容，760 nm波长处测吸光度，以蒸馏水为空白对照，没食子酸为对照品，采用外标一点法计算多酚含量。

1.3.3 方法学考察

1.3.3.1 精密度试验 重复测定同一草本水杨梅供试品显色后溶液6次，测吸光度并计算RSD。

1.3.3.2 稳定性试验 分别在0、0.5、1、1.5、2 h测定同一草本水杨梅供试品溶液显色中的多酚含量，计算得其RSD。

1.3.3.3 重复性试验 取同一样品粉末，按1.3.1项下方法分别制备6份供试品溶液，显色后测定多酚含量并计算其RSD。

1.3.3.4 加样回收率试验 取同一已知多酚含量的草本水杨梅药材粉末6份，精密称定，分别加入适量没食子酸标准品，按1.3.1项下方法制成供试品溶液，显色后测定其多酚含量，计算平均回收率和RSD。

1.3.4 草本水杨梅多酚提取的单因素试验 分别以乙醇浓度、超声时间、液固比3个因素作单因素试验，考察各因素对多酚提取率的影响。

1.3.5 响应面分析法优化工艺条件 根据单因素试验结果，进行响应曲面设计，优化草本水杨梅多酚的提取工艺。

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定 吸取不同梯度样品溶液3 mL与3 mL DPPH(质量浓度为0.04 mg·mL-1)溶液混合，室温避光静置30 min后测定515 nm处吸光度(A1)。同时测定3 mL乙醇与3 mLDPPH(A2)、3 mL样品溶液与3 mL乙醇(A3)的515 nm处吸光度，按如下公式计算DPPH清除率：SA%=(A2-A1+A3)/A×100%[19-21]。

1.3.6.2 还原能力测定(铁氰化钾法)分别取不同梯度样品溶液2.5 mL，加入浓度为0.2 mol·mL-1的磷酸盐(pH=6.6)缓冲液2.5 mL和1%铁氰化钾[K3Fe(CN)6]2.5 mL，混合均匀，于50 ℃反应20 min，放凉，再加入2.5 mL10%三氯乙酸。从上述混合液中取出2.5 mL放入新的刻度试管中，加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%氯化铁(FeCl3)溶液，以甲醇为空白对照，BHT、VC为对照品，在700 nm波长处测定吸光值。铁离子还原法测定的吸光度值越高，则代表该化合物还原力越强[22-23]。

1.3.7 数据处理 采用SAS Server 7.0软件对试验结果进行响应面分析，建立数学模型，用岭脊分析优化试验工艺，并采用Origin V8.0软件进行直观作图分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度的确定 在超声时间为30 min、液固比为200 mL·g-1的条件下，分别采用体积分数为0、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液提取草本水杨梅多酚，乙醇浓度和多酚提取率的关系见图1。

图1 乙醇浓度对多酚提取率的影响

由图1可知，随乙醇浓度增加，提取率呈现出先增加后逐渐降低的趋势，其中以60%乙醇溶液提取效果最好。由于多酚是一大类极性范围很广的物质，根据相似相溶原理，当提取溶剂的极性与多酚的极性接近时，多酚的提取效果会更好，所以适当的乙醇浓度有利于醇溶性和水溶性多酚的溶出[24]。考虑到提取成本及操作方便性，可将乙醇浓度考察范围定为0～60%。

2.1.2 超声时间的确定 在液固比200 mL·g-1、乙醇浓度为60%的条件下，分别超声提取5、10、20、30、40、50 min，超声时间和多酚提取率的关系见图2。

图2 超声提取时间对多酚提取率的影响

由图2可知，整体趋势上，随着超声提取时间的延长，草本水杨梅中多酚的溶出量逐渐增大。10～20 min，提取率增长缓慢；20～40 min，提取率增加较快；40～50 min，提取率增加平缓。考虑到实际生产中的耗能和效率问题，提取时间过长会使生产周期延长，提高生产成本，增高能耗[22]，因此超声提取时间考察范围定为20～50 min。

2.1.3 液固比的确定 分别以液固比20、50、100、150、200、250、300 mL·g-1，60%乙醇溶液对草本水杨梅超声提取50 min，液固比和多酚提取率的关系见图3。

图3 液固比对多酚提取率的影响

由图3可知，随液固比增大，草本水杨梅中多酚提取率逐渐增大。液固比20～150 mL·g-1，提取率增加幅度较大；液固比150～300 mL·g-1，提取率增加缓慢。考虑到实际生产中溶剂回收问题，应尽可能选择较小的液固比，液固比的考察范围定为100～250 mL·g-1。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 由精密度试验结果得吸光度平均值为0.402，吸光度RSD值为0.87%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.2 稳定性试验 由稳定性试验结果得多酚含量平均值为4.97%，多酚含量RSD值为2.16%(n=5)，表明稳定性良好。

2.2.3 重复性试验 由重复性试验结果得多酚含量平均值为4.91%，多酚含量RSD值为2.44%(n=6)，表明重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验 由加样回收率试验结果得平均回收率为99.96%，RSD值为1.75%(n=6)，表明回收率较好，方法稳定、可靠，可用于草本水杨梅多酚的含量测定。

2.3 响应面分析法优化工艺条件

2.3.1 响应面设计及结果 根据响应面设计原理，综合单因素试验结果，以草本水杨梅多酚提取率(Y)为响应值，通过响应曲面分析法优化提取条件。以影响多酚提取率的3个因素：乙醇浓度(A)、超声时间(B)、液固比(C)为自变量，采用三因素五水平的响应面分析试验。试验因素与水平设计见表1，响应面分析方案与结果见表2，其中1～12组为析因试验，13～17组为中心试验，用来分析试验误差。

表1 草本水杨梅多酚提取工艺响应面分析试验因素与水平

表2 草本水杨梅多酚提取工艺响应面分析试验设计及结果(n=3)

2.3.2 响应面分析 利用SAS Server7.0统计软件对试验数据进行回归拟合，得到回归模型参数估计值，见表3，方差分析表见表4，脊岭分析表见表5。

表3 回归系数显著性检验表

注：**影响极显著，P<0.01；*影响显著，P<0.0 5；N影响不显著，P>0.05。下同。

由表3可得，草本水杨梅多酚的提取量对所选3个因素的二次多项回归模型Y=-1.954309+0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2-0.001812AB-0.003442B2+0.000323AC+0.000366BC-0.000162C2。在一次项的预测中，乙醇浓度(A)对多酚提取率的影响最大(P<0.01)，达到极显著水平。超声提取时间(B)和液固比(C)对多酚提取率的影响较大(P<0.05)，达到显著水平，三者影响大小顺序为：乙醇浓度(A)>超声提取时间(B)>液固比(C)；在二次项的预测中，A、B和C都达到了极显著水平(P<0.01)；在交互项中，A乘以B、A乘以C都达到了显著水平(P<0.05)；截距和交互项中的B乘以C均影响不显著(P>0.05)，删除不显著项，形成校正的回归方程：Y=0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2-0.001812AB-0.003442B2+0.000 323AC-0.000162C2，其对提取率的预测值与实测值误差较大。因此，放弃对回归方程的校正，在P<0.5水平上接受所有系数及截距的假设。最终确定多酚提取率的回归方程为：Y=-1.954309+0.189579A+0.240719B+0.040483C-0.002790A2- 0.001812AB-0.003442B2+0.000323AC+0.000366BC-0.000162C2。

表4 回归模型的方差分析

表4回归方程的方差分析可以看出，总模型、线性项、平方项的P<0.01，表明总模型和方程的线性项、平方项对多酚提取率的影响极显著；而方程的交互项的P<0.05，表明其对提取率的影响显著。相关性分析中，总模型的复相关系数r=0.965 1，表明回归方程对多酚提取率的预测值与实测值有较好的相关性。失拟性检验分析中，P>0.05，表明失拟性不显著，该回归方程无失拟因素存在，回归方程与实测值能较好地拟合。

表5 模型岭脊回归分析

岭脊分析结果，见表5，回归方程预测的多酚最佳提取条件：乙醇浓度为33.76%，超声提取时间36.94 min，液固比为201.78 mL·g-1。为验证模型的有效性，在上述条件下，进行了验证试验，3次重复性试验结果分别为：9.65%、9.67%、9.52%，试验值与预测值拟合良好，进一步说明模型的可行性。

根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析乙醇浓度、超声提取时间、液固比对提取量的影响。响应曲面及其等高线如图4～6所示。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[17]。图4～6直观地反映了各因素对响应值的影响。

图4 Y=f(B，C)响应面图形(固定A=30)

图5 Y=f(A，C)响应面图形(固定B=35)

对图进行分析可得出，乙醇浓度对多酚提取量影响极为显著，超声时间和液固比对多酚提取量的影响较为显著。由图4的等高线图可知，超声提取时间应在30 ～40 min选择，液固比应该在160 ～240 mL·g-1选择；由图5的等高线图可知，乙醇浓度应在30%～45%选择，液固比应该在170～230 mL·g-1选择；由图6的等高线图可知，乙醇浓度应在25%～50%选择，液固比应该在25 ～45 min选择。以上响应面图和等高线图的分析结果也进一步验证了通过岭脊分析而获得的最佳工艺参数。

2.4 草本水杨梅多酚抗氧化活性测定

2.4.1 草本水杨梅多酚对DPPH 自由基的清除能力 由图7可知，草本水杨梅多酚与Vc和BHT一样具有较好的清除DPPH自由基的能力。在试验浓度范围内，随着浓度的增加，其清除能力也逐渐增强，呈现较好的量效关系。因此，草本水杨梅多酚提取液具有较强的清除DPPH自由基能力。

图6 Y=f(A，B)响应面图形(固定C=175)

图7 草本水杨梅多酚对DPPH自由基的清除能力

2.4.2 草本水杨梅多酚的还原能力 由图8可以发现，草本水杨梅多酚的还原能力低于对照组Vc和BHT。整体来看，草本水杨梅多酚的还原能力随提取液质量浓度的增加而提高，有较好线性对应关系。

图8 草本水杨梅多酚还原能力测定

3 结论

3.1响应面分析法得到的超声波辅助提取草本水杨梅多酚最优工艺：乙醇浓度为33.76%，超声提取时间为36.94 min，液固比为201.78 mL·g-1，多酚提取量为9.67%。乙醇浓度、超声提取时间、液固比对草本水杨梅多酚的提取率有显著影响，影响大小顺序为：乙醇浓度>超声提取时间>液固比。

3.2通过测定DPPH自由基清除力和铁氰化钾还原法两种体外抗氧化评价试验，发现草本水杨梅多酚具有较强的自由基清除力及还原能力，在一定的浓度范围内，提取液质量浓度与抗氧化活性呈现出较好的线性关系。随着近几年对植物抗氧化成分研究的不断深入，植物性抗氧化物质在医药、食品行业等领域的使用日益增多。本研究为草本水杨梅资源的开发和利用提供了理论依据。

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Polyphenols fromGeumaleppicum：OptimizationofUltrasonic-assistedExtractionProcessbyResponseSurfaceMethodologyandAntioxidantActivityEvaluation

ZHANG Yue1，ZHAO Yan1*，CAI Enbo1，LIU Shuangli1，YANG He1，ZHANG Lianxue1*，WANG Shijie2

(1.Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University，Jilin Changchun 130118，China；2.College of Chinese Medicine，Jilin Academy of Agricultural Science and Technology，Jilin 132101，China)

Objective：The optimum conditions of ultrasonic extraction and antioxidant activities ofGeumaleppicum.Polyphenols(GP)were investigated in this paper.Methods：Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of GP.On the basis of one-factor-at-a-time experiments，polyphenols yield was investigated by response surface methodology with respect to ethanol concentration，ultrasonic time and solid-liquid at five levels.Results：The optimum extraction conditions were as follows：ethanol concentration 33.76%，ultrasonic time 36.94 min and solid-liquid 201.78 mL·g-1，and under this conditions，the yield of GP was 9.67%.The primary and secondary order of three factors affecting on extraction rate of GP were ethanol concentration>ultrasonic time>solid-liquid.The antioxidant activityinvitroof the obtained extract was evaluated by DPPH free radical scavenging assay and total reducing power using water-soluble Vc and BHT as the control.DPPH free radical scavenging capacity and reducing power increased with the increasing concentration of GP in a linear dose-dependent manner.Conclusion：Optimization of the extraction process by RSM of GP is convenient and feasible.GP has good antioxidant activity，and this laid the foundation for the development and utilization of resources ofG.aleppicum.

GeumaleppicumJacq.；polyphenols；response surface methodology(RSM)；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.017

2014-06-12)

国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01)；国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项(20126046, 20140204013YY, YYZX201258)；国家自然科学基金(31000154)

*

赵岩，副教授，硕士生导师；E-mail：zhyjlu79@163.com； 张连学，教授，博士生导师；E-mail：zlx863@163.com