HPLC同时测定耳聋左慈丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量

徐建，方成武，邓艳梅

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800;3.安徽省滁州市食品药品检验中心，安徽 滁州 239000)

·中药工业·

HPLC同时测定耳聋左慈丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量

徐建1,3，方成武1,2*，邓艳梅3

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800;3.安徽省滁州市食品药品检验中心，安徽 滁州 239000)

目的：建立耳聋左慈丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量的液相色谱测定法。方法：采用Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱；紫外监测波长为235 nm；流速为1.0 mL·min-1。结果：马钱苷进样量在0.086 72～0.867 2 μg与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 5(n=6)，平均回收率为99.50%，RSD=0.43%；芍药苷进样量在0.189 28～1.892 8 μg与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9(n=6)，平均回收率为99.20%，RSD=0.47%；丹皮酚进样量在0.171 04～1.710 4 μg与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 8(n=6)，平均回收率为99.27%，RSD=0.31%。结论：该方法处理简单，结果准确可靠。

耳聋左慈丸；马钱苷；芍药苷；丹皮酚；高效液相色谱法

耳聋左慈丸由熟地黄、山茱萸、牡丹皮等8味药物组成，具有滋肾平肝的功能，用于肝肾阴虚、耳鸣耳聋、头晕目眩，效果显著[1-4]。现行标准《中华人民共和国药典》2010版一部只有山茱萸中的马钱苷含量测定，为了有效控制其质量，现用液相色谱法同时测定其中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱；Waters 2998二极管阵列检测器；马钱苷、芍药苷、丹皮酚(中国食品药品检定研究院，批号分别为：111640-200502，110736-201136，110708-200506)；耳聋左慈丸(上海和黄药业有限公司，批号分别为：130407，120811，121203)；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Acclaim C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取马钱苷对照品5.42 mg、芍药苷对照品10.69 mg、丹皮酚对照品11.83 mg，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液；再分别精密吸取母液5 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取耳聋左慈丸，研细，取1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，精密称定重量，超声处理60 min，放冷至室温，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照试验

按处方比例分别制备缺山茱萸和牡丹皮药材的阴性药品，按2.3方法，得到阴性供试品溶液。取对照品溶液、阴性供试品溶液与供试品溶液，按2.1色谱条件测定，得到色谱图。结果在与马钱苷、芍药苷和丹皮酚相同保留时间处，供试品溶液出现对照品色谱峰，阴性对照溶液无该色谱峰出现，表明阴性对照无干扰，见图1。

1.马钱苷；2.芍药苷；3.丹皮酚A.对照品；B.样品；C.缺牡丹皮阴性对照；D.缺山茱萸阴性对照。图1 耳聋左慈丸及对照品HPLC图

2.5 线性关系

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，进行测定，记录峰面积，以对照品峰面积Y，对进样量X(μg)进行线性回归，得回归方程马钱苷：Y=1 601 403X+8988，r=0.999 5。结果表明，马钱苷在0.086 72～0.867 2 μg具有良好的线性关系；芍药苷：Y=1 261 310X-26 600，r=0.999 9。结果表明，芍药苷在0.189 28～1.892 8 μg具有良好的线性关系；丹皮酚：Y=2 845 476X+25 490，r=0.999 8。结果表明，丹皮酚在0.171 04～1.710 4 μg具有良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取2.2项下混合对照品溶液8 μL，连续进样5次，记录峰面积。结果马钱苷、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.3%、0.6%和0.5%。结果表明，马钱苷、芍药苷和丹皮酚精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一耳聋左慈丸样品(批号：130407)5份，每份1.0 g，按正文方法提取制备并测量，马钱苷、芍药苷、丹皮酚质量分数分别为0.75、1.09、1.66 mg·g-1，RSD为分别1.2%、1.3%和1.8%。结果表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取供试品溶液(批号：130407)，分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样8 μL，记录峰面积。结果马钱苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积的RSD分别为1.0%、0.9%和0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的同一批样品(批号：130407)9份，每份1.0 g，精密称定，分别精密加入马钱苷对照品溶液(质量浓度为0.216 8 mg·mL-1)2、3、4 mL、芍药苷对照品液(质量浓度为0.427 6 mg·mL-1)2、3、4 mL和丹皮酚对照品液(质量浓度为0.473 2mg·mL-1)3、4、5 mL，按正文含量测定的方法操作。按2.1色谱条件测定，记录色谱图，计算马钱苷平均回收率为99.50%，RSD=0.43%；芍药苷平均回收率为99.20%，RSD=0.47%；丹皮酚平均回收率为99.27%，RSD=0.31%。结果见表1～3。

2.10 样品含量测定

取3批耳聋左慈丸，精密称取样品1 g，按2.1色谱条件进行测定并计算，结果见表4。

表1 耳聋左慈丸中马钱苷回收率试验

表2 耳聋左慈丸中芍药苷回收率试验

表3 耳聋左慈丸中丹皮酚回收率试验

表4 样品测定(n=3)

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流动相体系，发现以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相体系进行梯度洗脱时，其分离度、理论塔板数、峰的对称性及出峰时间均达到满意的结果，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相体系。

3.2 检测波长的选择

对照品溶液用DAD检测器进行监测，发现马钱苷最大吸收波长为236 nm；芍药苷最大吸收波长为230 nm；丹皮酚在230、273 nm处均有吸收峰，参考相关文献[1，5-9]，并通过比较，发现吸收波长在235 nm时各峰均有较好的响应，并且峰形较好，故选择在235 nm处测定较为理想。

3.3 提取条件的选择

笔者通过文献查阅和试验摸索[1，5-9]，考察了马钱苷、芍药苷和丹皮酚的最佳提取条件。曾分别用50%甲醇、80%甲醇、甲醇和乙醇为提取溶液，超声处理60 min，结果80%甲醇超声处理60 min提取效率最好，其效果和超声提取相差无几，故选用80%甲醇超声提取60 min的提取方法。

3.4 结论

通过提取条件的优化、色谱条件的选择及系统性试验的考察，说明该方法快速，结果准确可靠，可以为提高耳聋左慈丸的质量控制提供参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：674-675.

[2] 张振荣，刘新年，师允坤，等.耳聋左慈丸治疗神经性耳鸣、耳聋的临床观察[J].山东医药，1999，39(7)：63.

[3] 李冠豪，何新芳，赖新生.针刺风市穴治疗神经性耳鸣耳聋[J].中国针灸，2006，26(6)：418.

[4] 徐伟，刁复强.马钱昔对人体健康的潜在作用[J].国外医学卫生学分册，1998，25(2)：81-84.

[5] 陈英红，姜瑞芝，高阳.HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷和丹皮酚的含量[J].中国药事，2007，21(9)：733-735.

[6] 朱山寅.高效液相色谱法测定耳聋左慈丸中芍药苷的含量[J].现代中药研究与实践，2005，19(1)：46-47.

[7] 陆旋，张星海，黄雪梅.HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷方法研究[J].浙江化工，2010，41(5)：29-31.

[8] 宫淑枝，朱晓威.HPLC法测定耳聋左慈丸中丹皮酚的含量[J].中国医药指南，2010，8(12)：48-49.

[9] 张先瑞.HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷的含量[J].国际医药卫生导报，2007，13(16)：113-115.

Simultaneous Determination of loganin，Paeoniflorin and Paeonol in Erlongzuoci Pills by HPLC

XU Jian1,3，FANG Chengwu1,2*，DENG Yanmei3

(1.Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038,China;2.Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou 236800,China;3.Chuzhou Institute for Food and Drug Control，Anhui Chuzhou 239000,China)

Objective：To determine the content ofloganin，paeoniflorin and paeonol simultaneously in Erlongzuoci Pills by HPLC.Methods：With gradient elution，Acclaim C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)was used as chromatographic column with the acetonitrile -0.1% phosphoric acid as the mobile phase.The UV wavelength was 235 nm，and the flow rate was 1.0 mL·min-1.Results：The linear range for loganin was 0.086 72-0.867 2 μg，r=0.999 5(n=6).The average recovery was 99.58% and RSD was 0.43%；The linear range for paeoniflorin was 0.189 28-1.892 8 μg，r=0.999 9(n=6).The average recovery was 99.20% and RSD was 0.47%.The linear range for paeonol was 0.171 04-1.710 4 μg，r=0.999 9(n=6).The average recovery was 99.27% and RSD was 0.31%.Conclusion：The established method is simple reliable.

Erlongzuoci Pills；loganin；paeoniflorin；paeonol；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.015

2014-06-09)

*

方成武，教授，研究方向：中药资源与质量研究；E-mail：cwfang1961@sina.com