大黄素抑制软脂酸诱导的大鼠VSMCs炎性细胞因子的表达△

吴迪，钟珊珊

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563000)

·基础研究·

大黄素抑制软脂酸诱导的大鼠VSMCs炎性细胞因子的表达△

吴迪*，钟珊珊

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563000)

目的：探讨大黄素对软脂酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)炎症细胞因子CRP、TNF-α及iNOS的影响。方法：培养鉴定原代大鼠VSMCs，使用不同浓度的大黄素(1、10、50 μmol·L-1)预孵育VSMCs 24 h，再以浓度为100 μmol·L-1的软脂酸刺激24 h，使用RT-PCR、western blot分别测定VSMCs CRP、TNF-α、iNOS 的mRNA和蛋白的表达变化。结果：浓度为50 μmol·L-1的大黄素预孵育大鼠VSMCs 24 h后，与软脂酸组相比，CRP、TNF-α、iNOS的mRNA及蛋白的表达显著性降低，且差异有统计学意义(P<0.05)。结论：大黄素能浓度依赖性地抑制软脂酸诱导的大鼠VSMCs 炎性因子的表达，可以通过抗炎而达到抗动脉粥样硬化的作用。

大黄素；软脂酸；血管平滑肌细胞；细胞因子；动脉粥样硬化

大黄素(emodin，EMO)属蒽醌类衍生物，可以通过调脂、抗氧化、保护内皮细胞等途径，发挥抗动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)功能。EMO可以抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)核抗原蛋白的表达，阻滞细胞周期的移行，抑制VSMCs的增殖[1]，而达到抗As的作用。现代研究表明，炎症反应参与了As的发生和发展，EMO对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应具有明显的抑制作用，可以抑制NF-κB的活化，抑制炎症反应中一氧化氮(NO)的大量合成和释放[2]。但EMO对VSMCs炎性细胞因子的研究不多，对抗炎、抗As的研究也不多，且机理不明。本研究拟设计实验，探讨EMO对软脂酸(palmitic acid，PA)诱导的VSMCs炎症细胞因子表达的影响，研究EMO的抗As作用，深入了解EMO药理作用，为其临床使用提供新的思路。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠，雄性，体重100～150 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXX 2012-005。

1.2 药品及试剂

EMO(陕西中鑫生物技术有限公司)；PA(美国Sigma公司)；DMEM 高糖培养基、胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)；C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗体(美国Abcam公司)；GAPDH抗体、兔抗大鼠平滑肌α-actin抗体、辣根酶标记山羊抗兔lgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗鼠lgG(H+L)、SP-9000免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物)；逆转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

2 方法

2.1 大鼠血管平滑肌细胞的培养

100～150 g的SD雄性大鼠，麻醉后在无菌条件下迅速开胸，取出大鼠胸主动脉段，使用PBS洗涤3次，剥去外膜，刮去内膜。将处理好的中膜移入培养皿中，剪成大约1 mm的碎片，将碎片均匀铺于培养瓶壁上，将瓶翻转，再加入含20% FBS的DMEM培养基，放入培养箱(37 ℃，5% CO2)，2～4 h后将瓶轻轻翻回，使组织块完全浸泡在培养液中。待单层细胞铺满培养瓶80%左右时，采用酶消化法传代。实验中采用3～7代细胞，细胞在实验前，换成含0.4% FBS的DMEM培养基，去血清培养24 h，使细胞同步化。

2.2 VSMCs的鉴定

取浓度为1×106/mL第3代VSMCs，接种于预置有盖玻片的6孔板中培养，待细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，PBS冲洗。4%多聚甲醛固定20 min，0.3%Tritonx-100室温孵育20 min，羊血清室温封闭20 min，兔抗大鼠平滑肌α-actin抗体(1∶100)孵育[3]，4 ℃过夜。PBS冲洗后加入生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min，加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗后，DAB显色5 min，显微镜下观察。待显色完成后用PBS冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.3 实验分组

实验分为空白对照组(NC组)、PA组、EMO组、EMO+PA组。NC组VSMCs不做任何处理；PA组用PA(100 μmol·L-1)刺激24 h；EMO组用EMO(50 μmol·L-1)刺激24 h；EMO+PA组用不同浓度EMO(1、10、50 μmol·L-1)预孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h。RT-PCR法测定细胞内CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表达，Western blot法测定蛋白的表达。

2.4 RT-PCR测定

按照RNAfast200试剂盒说明书所示规程提取细胞总RNA，使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。RNA提取后依照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。以GAPDH为内参，扩增CRP、TNF-α及iNOS基因。GAPDH上游引物(产物124 bp)：5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物：5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-5′；CRP上游引物(产物153 bp)：5′-CATCTGTGCCACCTGGGAGTC-3′，下游引物：5′-AAGCCACCGCCATACGAGTC-3′；iNOS上游引物(产物262 bp)：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′，下游引物：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′；TNF-α上游引物(产物381 bp)：5′-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′。产物电泳后，采用Quantity one 4.6软件分析扩增产物条带灰度，取目的基因与GAPDH的灰度值的比值为该目的基因的相对含量。实验重复3次，取平均值。

2.5 Western blot测定

用RIPA裂解液收集细胞，将细胞从六孔板中转移至1.5 mLEP管中，用破膜仪抽打3次，使蛋白充分溶解。将EP管静置于冰上20 min，再离心15 min，吸取上清液，即得细胞总蛋白。利用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离等量蛋白，然后转膜、封闭，分别加入CRP(1∶100)、iNOS(1∶300)、TNF-α(1∶200)及GAPDH(1∶500)抗体12 h，洗膜后加入二抗(1∶5000)，室温孵育1 h，洗膜后采用化学显影，X线片曝光，并对显影条带进行灰度扫描，做相对定量分析，以GADPH为内参照。

2.6 统计学分析

实验所得数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，多组间比较使用ANOVA单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

3 结果

3.1 体外培养大鼠VSMCs的鉴定

倒置显微镜下，3～5 d即可见少量细胞爬出组织块，细胞呈典型梭形，有一个椭圆形核，胞浆均质)。培养7～10 d，细胞局部成束状平行排列，部分细胞多层重叠，呈典型高低起伏的“峰”、“谷”状。使用免疫细胞化学染色方法检测平滑肌肌动蛋白的表达，鉴定培养的第三代细胞。结果显示：大于99%的细胞染色阳性，胞核不着色，胞浆显棕黄色，见图1。

3.2 大黄素抑制软脂酸诱导的VSMCs炎性细胞因子mRNA的表达

VSMCs先用不同浓度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)预孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h，提取细胞mRNA，RT-PCR法分别检测细胞中CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表达。以GADPH为标准统计目的基因的表达水平，数据以均数±标准误表示(n=3)。结果显示，与正常对照组相比，100 μmol·L-1PA能显著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-αmRNA的表达，50 μmol·L-1EMO本身对目的基因mRNA的表达无显著影响。与PA组比较，不同浓度的EMO能够抑制PA刺激的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表达，其中高浓度的EMO差异有统计学意义，见图2。

A.倒置显微镜下第4天细胞形态(×100)；B.倒置显微镜下第三代细胞形态(×100)；C.免疫细胞化学染色鉴定大鼠血管平滑肌肌动蛋白(×400)。图1 大鼠血管平滑肌细胞的鉴定

注：与对照组相比，**P<0.01，***P <0.001；与软脂酸组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P <0.001(n=3)。下同。图2 大黄素抑制软脂酸诱导的VSMCs炎症细胞因子mRNA的表达

3.3 大黄素抑制软脂酸诱导的VSMCs炎性细胞因子蛋白的表达

VSMCs先用不同浓度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)预孵育24 h后，加入PA(100 μmol·L-1) 24 h，提取细胞总蛋白，Western blot法分别检测细胞中CRP、iNOS及TNF-α蛋白的表达。以GADPH为标准统计目的蛋白的表达水平，数据以均数±标准误表示(n=3)。结果显示，与正常对照组相比，100 μmol·L-1PA能显著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表达，50 μmol·L-1EMO本身对目的蛋白的表达无显著影响。与PA组比较，不同浓度的EMO能够抑制PA刺激的VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表达，其中高浓度的EMO差异有统计学意义，见图3。

图3 大黄素抑制软脂酸诱导的VSMCs 炎症细胞因子蛋白的表达

4 讨论

As是一种慢性炎性疾病，这一观点已得到研究者的公认。VSMCs在As的发展中发挥着重要作用，其能分泌一系列的炎症因子，如CRP、TNF-α、IL-6及MMPs等，促进血管炎症反应，加剧As。

CRP作为心血管疾病的独立预测因子，在中风、心肌梗死及冠心病等疾病的预防和治疗中具有重要意义[4]，CRP也作为炎性细胞因子参与As的整个过程。研究显示，CRP可以诱导VSMCs生成ROS、上调AT1-R的表达，活性氧(ROS)、AT1-R表达的增加又促进新生内膜的形成及增厚，促进VSMCs的增殖迁移，从而促进粥样斑块的形成和破裂[5]，这一过程可能与MAPK及NF-κB的激活有关[6]。iNOS在多种细胞中均有表达，如巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和VSMCs等。当细胞受到炎症介质刺激时，iNOS催化合成大量NO，造成细胞脂质过氧化、细胞坏死，释放更多炎症介质，加重炎症反应，加剧iNOS的表达，形成恶性循环，促进粥样斑块的破裂[7]。TNF-α是生物体内主要的促炎和免疫调节因子，参与机体的急、慢性炎症，在人和小鼠的动脉粥样病变区域中都检测到TNF-α，其分泌过多会引起炎症因子的瀑布式释放，造成组织细胞损伤。TNF-α可以诱导VSMCs炎症因子IL-6、IL-1β的表达，可以促进VSMCs成骨样分化，增加钙盐沉积，从而促进血管钙化[8]。TNF-α还能激活VSMCs MAPK信号转导通路，促进VSMCs的增殖[9]。

EMO是传统中药大黄的主要有效单体，其在抑制细胞增殖、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等方面具有良好效果。临床研究表明，EMO能降低全身炎症反应综合征患者血清TNF-α和CRP的水平，有效抑制炎症介质的释放及阻止炎症介质介导的严重并发症的发生，具有良好的抗炎作用[10]。通过体外实验研究，我们发现PA可以诱导大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA和蛋白水平的表达，其对VSMCs有直接的致炎作用，这表明PA可以直接通过炎症介导As的发生发展。在核酸和蛋白水平上，EMO可以显著抑制PA对大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的诱导作用，50 μmol·L-1的EMO本身对CRP、iNOS及TNF-α的表达没有显著的影响，表明EMO可以通过抑制炎症因子的表达而达到抗As的作用。EMO能抑制PA诱导的炎症反应从而抑制AS发展的作用机制仍不明确，体外实验结果和具体的信号通路我们仍然未知，需要进一步的研究及探讨。

综上，本研究发现EMO可以抑制PA诱导的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的表达，提示EMO可以通过抑制炎症反应的发生、发展，从而达到抗As的作用，加深了我们对EMO抗炎机制和抗As的理解，为EMO的临床应用及传统中药大黄治疗心血管疾病提供了参考。

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封面介绍——红旱莲

【异名】红旱莲异名湖南连翘。

【基原】为藤黄科金丝桃属植物湖南连翘的全草。

【原植物】湖南连翘HypericumascyronL.又名黄海棠。

【植物形态】为多年生草本，高1.3 m。全株光滑无毛。茎四棱形，淡棕色，上部有分枝。单叶对生；叶无柄；叶片宽披针形，长5-10cm,宽1-3cm。先端钝尖，基部抱茎，边缘全缘，两面密布细小透明的腺点。花数朵排成顶生的二歧聚伞花序；花黄色，萼片5，卵圆形，具半透明腺点；花瓣5，镰状倒卵形，各瓣稍偏斜而旋转；雄蕊多数，基部连合成5束，每束与花瓣对生；子房上位，圆锥形，花柱长，在中部以上5裂。蒴果圆锥形。种子多数，长椭圆形，褐色。花期6-7月，果期8-9月。

【性味与归经】苦，寒。归肝经。

【功能主治】凉血止血，活血调经，泻火解毒。注治血热吐血、咯血、衄血、尿血、崩漏，跌打损伤，外伤出血，月经不调，痛经，乳汁不下，肝火头痛，黄疸，疟疾，烫伤，湿疹，黄水疮，毒蛇咬伤。

Inhibitory Effect of Emodin on Inflammatory Cytokines Expression Induced by Palmitic Acid in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

WU Di*，ZHONG Shanshan

(Department of pharmacy，Zunyi Medcal University，Zunyi Guizhou 563000，China)

Objective：To observe the effects of emodin on CRP，TNF-α and iNOS generations induced by palmitic acid in rat vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods：After VSMCs were pretreated with different concentrations of emodin(1，10，50 μmol·L-1) for 24 h，VSMCs were treated with palmitic acid(100 μmol·L-1) for 24 h.At the indicated time，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS in VSMCs were analyzed by RT-PCR，western blot，respectively.Results：In VSMCs，using 50 μmol·L-1of emodin for 24h before the stimulation with palmitic acid，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS expressions were significantly decreased comparing with palmitic acid group.Conclusion：Emodin inhibits inflammatory cytokines expression induced by palmitic acid in VSMCs and has effect on atherosclerosis by its anti-inflammatory activity.

Emodin；palmitic acid；vascular smooth muscle cells；cytokines

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.005

2014-06-23)

遵义医学院硕士启动项目(F-669)

*

吴迪，讲师，研究方向：心血管药理学；E-mail：wd_32677@126.com