铁沉积对大鼠肝纤维化影响的机制研究*

江 远，张 玲，钟肖英，吴文如，何金洋

铁沉积与肝纤维化（Liver fibrosis，LF）关系密切。含铁血黄素（Hemosiderosis）可沉积在各种类型的肝硬化[1，2]、慢性病毒性肝炎[3]患者肝组织中，而铁过载又会进一步促进肝硬化和肝癌的发生[4～6]。临床资料显示，去铁治疗能显著改善血清LF指标[7]。我们前期实验表明，炎症反应是铁沉积于巨噬细胞并促进LF发生的机制之一[8]，且不同铁负载水平能够诱导肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）活化或发生细胞凋亡，提示铁螯合剂治疗LF的潜在作用[9]。本研究在本课题组成功建立实验性LF大鼠模型的基础上[10]，以去铁铵腹腔注射SD大鼠作为对照，探讨铁沉积影响LF的发生机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SD大鼠39只，体质量110～140 g，雌雄各半，购于广东省医学实验动物中心（合格证号：0029666）。鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（Anti-αsmooth muscle actin，α-SMA，批号：BM0002）、山羊抗小鼠 IgG（SA1020）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（AR1022）由武汉博士德生物工程公司提供。新鲜配制普鲁士蓝染色所需染液：2%亚铁氰化钾50 ml+浓盐酸1 ml。铁标准溶液1000μg/mL由国家标准物质中心提供。ASCENT型酶标仪为芬兰雷勃公司产品。AU400型奥林巴斯全自动生化分析仪由日本奥林巴斯公司提供。JENA AA400型原子吸收分光光度计由德国JENA仪器公司提供。TGF-β1引物由加拿大Fermentas公司合成。Master mix荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自日本TOYOBO公司。TRIzol RNA提取试剂购于美国MRC公司。

1.2 肝纤维化大鼠模型制备 取SD大鼠39只，随机分为模型组和空白对照组。模型组（n=27）以二甲基亚硝胺（DMN，天津化学试剂研究所）10μL.kg-1腹腔注射，每周连续3日，共4 w；空白对照组（n=12）予以等体积生理盐水腹腔注射。在造模成功后，再将模型大鼠随机分为模型组（n=15）和去铁铵组（n=12）。分别给予两组模型大鼠生理盐水或去铁铵（诺华制药厂）100 mg·kg-1腹腔注射，3次/w，共2 w。实验结束时，按要求收集血清，摘取左前叶肝脏，分别待检。

1.3 血生化指标和血清铁检测 使用AU400型奥林巴斯全自动生化分析仪检测。

1.4 血清铁蛋白和转铁蛋白检测 采用ELISA法检测（美国ADL公司）。

1.5 大鼠肝组织铁浓度（Hepatic iron concentration，HIC）检测 按照有关文献[11]报道的方法，采用火焰原子吸收光谱法测定。

1.6 肝组织病理学检查 取肝组织，在Bouin's固定液中固定24 h～36 h，石蜡包埋，切片，分别行HE染色、Masson染色和普鲁士蓝染色。按照参考文献[12，13]报道的方法进行肝组织胶原半定量分析。

1.7 肝组织α-SMA表达检测 按照试剂盒说明书提供的方法操作。

1.8 肝组织TGF-β1 mRNA水平检测 按TRIzol提取试剂盒操作说明进行总RNA提取，立即行逆转录。将目的基因与内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的比值作为该目的基因的相对水平。

1.9 统计学处理 应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，计量资料以（）表示，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验，多样本有序分类资料的两两比较采用Ridit分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织病理学表现 对照组肝组织肝小叶排列整齐，无病理学改变；模型组肝组织可见大量纤维沉积，肝小叶结构破坏，部分肝组织出现脂肪堆积，汇管区大片炎细胞浸润，肝组织大片出血灶，伴随着纤维组织增生，甚至有假小叶形成。肝组织内有棕褐色颗粒样物质（铁）沉积，且主要沉积在库弗细胞（KC）中；去铁铵组肝细胞变性坏死有所减轻，纤维结缔组织和假小叶形成均有所减少（图1～3）。

图1 肝组织病理学表现 对照组肝组织肝小叶排列整齐，无病理学改变（HE，400×）

图2 肝组织病理学表现 模型组大鼠肝组织可见纤维组织增生，假小叶形成。肝组织内有棕褐色颗粒样物质（铁）沉积，且主要沉积在 KC 中（HE，400×）

图3 肝组织病理学表现 去铁铵腹腔注射后，肝组织肝细胞变性坏死有所减轻，纤维结缔组织和假小叶形成均有所减少（HE，400×）

2.2 肝组织胶原情况 对照组肝组织仅有少量胶原纤维沉积在汇管区和中央静脉壁；模型组胶原纤维染色显著增强，可见纤维间隔，甚至有假小叶形成；去铁铵组胶原纤维增生明显减轻，纤维间隔变窄，较少有假小叶形成（图4～6）。半定量分析胶原结果表明，模型组胶原沉积较对照组和去铁铵组明显增加（P＜0.05，表1）。

2.3 铁负载水平比较 经普鲁士蓝染色，结果显示各组肝组织铁负载水平不同，即呈模型组＞去铁铵组＞对照组趋势。深蓝色铁颗粒主要沿纤维间隔分布，铁主要沉积在KC，或为被KC吞噬（图7～9）。

图4 肝组织胶原情况 对照组肝组织仅有少量胶原纤维沉积在汇管区和中央静脉壁（Masson，400×）

图5 肝组织胶原情况 模型组肝组织胶原纤维染色显著增强，可见纤维间隔（Masson，400×）

图6 肝组织胶原情况 去铁铵腹腔注射后，肝组织胶原纤维增生明显减轻，纤维间隔变窄，少有假小叶形成（Masson，400×）

表1 各组大鼠肝组织胶原半定量结果比较

图7 肝组织铁染色结果 对照组肝组织无铁沉积（普鲁士蓝，400×）

图8 肝组织铁染色结果 模型组肝组织有大量棕褐色物质（铁）沉积，主要沿纤维间隔分布，铁主要沉积在KC（普鲁士蓝，400×）

图9 肝组织铁染色结果 去铁铵腹腔注射后，肝组织铁负载明显减少（普鲁士蓝，400×）

2.4 肝组织α-SMA表达情况 在模型组肝组织坏死区周围，沿着铁颗粒分布区域，有大量α-SMA表达阳性的HSC（即活化的HSC）和吞噬铁的KC同时出现在新形成的纤维间隔中，并且在活化的HSC中也出现铁颗粒沉积，提示在DMN诱导的LF大鼠，肝组织伴随着大量HSC活化，铁主要沉积于KC和HSC（图10～11）。

图10 肝组织α-SMA表达情况 对照组肝组织未见α-SMA表达（免疫组化，400×）

图11 肝组织α-SMA表达情况 模型组大鼠肝组织见大量α-SMA表达阳性的HSC（即活化的HSC）和吞噬铁的KC同时出现在新形成的纤维间隔中，在活化的HSC中也出现铁颗粒沉积（免疫组化，400×）

2.5 大鼠肝组织铁浓度的变化 根据实验步骤制作标准曲线（图12），结果表明，铁质量浓度在0.0～5.0 μg/mL范围内，线性良好。用标准溶液进行精密度实验，测得平均值为1.006μg/mL，相对标准偏差（RSD）为0.494%。加样回收率实验结果表明，回收率在98.86%～99.993%之间，平均回收率为99.61%。最后进行肝组织HIC测定（表2）。结果表明，模型组HIC为对照组的 1.78倍（LSD-t=5.15，P＜0.01），而去铁铵组HIC较模型组则减少了23.5%（LSD-t=-2.76，P＜0.05），提示正常大鼠肝组织含有一定量的铁，但随着LF的形成，铁沉积更加明显，而去铁铵处理则能减轻铁的沉积。

图12 铁原子吸收标准曲线和回归方程

表2 各组大鼠肝组织铁浓度（mg/g干重，）的变化

表2 各组大鼠肝组织铁浓度（mg/g干重，）的变化

与对照组比，①P＜0.01或P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

只数 肝铁质量浓度对照组 5 0.4±0.0模型组 5 0.8±0.1①去铁铵 5 0.6±0.1①②

2.6 大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白和血清铁水平变化 模型组血清铁蛋白水平是对照组的1.97倍（LSD-t=2.21，P＜0.05）；去铁铵能使模型组血清铁蛋白水平降低 78.5%（LSD-t=-3.52，P＜0.01）。模型组血清转铁蛋白仅为对照组的 49.3%（LSD-t=-4.78，P＜0.01）；而经去铁铵治疗，血清转铁蛋白则增加81.4%（LSD-t=3.77，P=0.01）。模型组血清铁水平显著减少（LSD-t=-2.50，P＜0.05），但去铁铵能进一步降低其血清铁水平（LSD-t=-2.43，P＜0.05，表 3）。

表3 各组大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白和血清铁水平（）比较

表3 各组大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白和血清铁水平（）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.01

血清铁（μmol/L）对照组 11 24.2±27.6 0.7±0.2 66.1±8.9模型组 11 47.7±27.9① 0.3±0.1① 49.7±20.6①去铁铵 10 10.3±12.5② 0.6±0.2② 33.4±15.9①②只数 铁蛋白（ng/mL）转铁蛋白（mg/mL）

2.7 铁沉积对DMN诱导的LF大鼠肝组织TGF-β1 mRNA水平的影响 模型组肝组织TGF-β1 mRNA水平为对照组的 5.2倍[（11.896±0.639）对（2.292±0.222），LSD-t=25.95，P＜0.01]，而经去铁铵治疗，其TGF-β1 mRNA水平下调了 37.1%[（7.481±0.745），LSD-t=-11.95，P＜0.01]。结果表明，LF大鼠肝组织TGF-β1 mRNA水平明显上调，而去铁铵能降低其水平，提示肝内铁沉积通过调控TGF-β1基因水平可能促进了LF的发生和发展。

3 讨论

Arezzini et al[4]研究显示添加羰基铁能促进亚剂量CCL4诱导的大鼠肝硬化发生。Mackinnon et al[14]报道亚毒性剂量CCL4蒸汽吸入的大鼠在添加铁和酒精后能促进LF的发展。给予酒精性肝病模型动物添加羰基铁导致了大鼠LF的组织病理学变化[15]。本课题组曾以DMN腹腔注射建立大鼠LF模型，发现铁负载和脂肪堆积是其显著的组织病理学特点[10]。

在本实验中，模型组大鼠肝损伤严重，肝组织有胶原纤维沉积、肝细胞变性坏死和大片出血灶，肝组织铁负载明显增加，铁主要沿纤维间隔分布。而用去铁铵治疗后，肝组织铁负载明显减少，胶原纤维沉积和肝细胞变性坏死明显减轻，提示铁沉积是促进大鼠LF形成的因素之一。

进一步研究发现，铁沉积于KC和 HSC并促进其活化是铁沉积影响大鼠LF发生的关键机制。首先，在DMN诱导的大鼠LF中，我们观察到铁负载的存在。用去铁铵治疗后，肝组织铁沉积和血清铁离子水平均明显下降；其次，通过普鲁士蓝染色及普鲁士蓝和α-SMA双染色发现，在LF大鼠肝组织中伴随着HSC大量活化，铁主要沉积于KC和HSC；再次，作为最重要的促纤维化细胞因子之一，肝组织TGF-β1 mRNA水平在LF大鼠明显上调，TGF-β1可通过自分泌和旁分泌途径使静止的HSC活化，从而促进LF的发生和发展。在DMN大鼠LF模型发现铁负载的KC和HSC TGFβ1蛋白表达均呈强阳性，提示铁沉积可能使KC表达TGFβ1蛋白增加从而影响HSC活化，促进了LF的进展[16]。

铁元素是细胞生长的基本物质，肝脏是铁储存的主要部位。肝脏出血是本次实验性LF大鼠的显著特征。伴随着出血性坏死及纤维化进展，红细胞中的铁主要被KC吞噬。运铁素（Ferroportin）能将储存在KC中的铁转出细胞外[17]，再被HSC摄取。由于HSC存在转铁蛋白受体[18]，转铁蛋白受体1（TfR1）作为一种2型跨膜蛋白，能够高亲和性地连接含三价铁的转铁蛋白，经细胞内吞途径转运到细胞内，在HSC内与铁蛋白结合，变成可储存的铁[19，20]。我们认为，在肝纤维化发生时，大量的铁沉积于肝组织并形成HSC活化的外环境，进一步促进了LF的进展，甚至导致肝硬化的发生。因此，有效地控制肝铁过载，对肝病的预防和治疗有着重要的临床意义。

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