针刺对脑出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影响

陈秋欣,邹伟,牛明明,刘鹏,姚冬,包宇,孙晓伟



针刺对脑出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影响

陈秋欣1,邹伟2,牛明明1,刘鹏1,姚冬1,包宇1,孙晓伟2

(1.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨 150040)

目的 探讨针刺对脑出血大鼠运动功能及血清TNF-a、IL-6表达的影响。方法 将72只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组。采用脑内自体血注射法制作脑出血大鼠模型。模型成功后,采用百会透曲鬓针刺法干预,1 d、3 d、7 d 3个时间点采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清TNF-a、IL-6含量的变化。结果 针刺百会透曲鬓穴可明显提高大鼠脑出血后神经功能评分,减轻神经功能缺损症状。同一时间点,针刺组大鼠血清中TNF-a和IL-6含量与模型组比较明显降低,其差异具有统计学意义(＜0.01)。结论 针刺百会透曲鬓穴能降低脑出血大鼠神经功能缺损情况,可能与针刺后血清中的TNF-a和IL-6含量降低有关。

针刺;肿瘤坏死因子;白介素-6;脑出血;大鼠

脑出血是起病较急、病情较重、死亡率高、致残率高的脑血管疾病。如何积极有效地降低神经功能的损伤,降低出血后炎症反应,修复损伤的神经元,成为急性脑出血治疗的重要内容。脑出血后,血肿周围组织如小胶质细胞等炎性细胞被激活,释放肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-1)等炎性因子,诱发炎症级联反应,加重脑水肿及神经元死亡,最终导致脑损伤和神经功能缺损加剧。TNF-a是具有多效性的促炎性细胞因子,而IL-6是一种主要由活化的单核巨噬细胞及B、T淋巴细胞和成纤维细胞、内皮细胞等分泌的具有多种生物功能的炎症细胞因子。本文拟观察针刺百会穴透刺曲鬓穴对实验性脑出血大鼠运动功能及血清中TNF-a及IL-6含量的影响,探讨针刺是否能调控炎症反应来降低脑出血神经功能损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性Wistar大鼠,体重(350±20)g,由哈尔滨兽医研究所提供[证书编号SCXK(黑) 20100027],实验动物饲养室温度为(22±2)℃,湿度为(50±5)%,氨浓度应≤14 rag/m3,噪音＜60 dB。

1.2 实验试剂

TNF-a、IL-6试剂盒,购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 脑出血模型建立

参照张国威等[1]和Rosenberg GA等[2]报道的方法制作脑出血大鼠模型。将大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上,取头皮正中,备皮消毒,正中切口,骨膜剥离器剥离骨膜,取前囟点(Bregma)点右旁开3.5 mm,后0.2 mm定点,用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔,深达硬脑膜表面,鼠尾乙醇消毒,距尾端3 cm处剪断鼠尾,用微量注射器取血50mL,将其固定在立体定位仪上,沿钻孔进针约6 mm,将未肝素化的血液50mL以20mL/min速度推进脑内,留针5 min,缓慢出针。留针期间乙醇棉球包扎鼠尾断端伤口,术后局部喷洒庆大霉素,用牙科水泥封闭颅骨伤口,缝合头皮,局部皮肤采用碘酚消毒,防止局部感染影响指标观察。术后2 h,采用Berderson评分法评价大鼠的运行功能,1～3分者纳入本实验。

1.4 动物分组及干预方法

将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,每组按1 d、3 d、7 d分为3个亚组,每组8只。

假手术组:动物接受类似处理组的各项手术操作,但不进行注血制作。

模型组:脑出血模型成功后,不进行任何干预。

针刺组:脑出血模型制备12 h后进行针刺干预。

1.5 针刺方法

参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》,取患侧百会穴、曲鬓穴,采取百会穴透曲鬓穴针刺法,用0.35 mm×25 mm毫针针刺,进针0.8寸,留针30 min,其间捻转3次,每次5 min,以200转/min速度捻针。

1.6 指标检测方法

1.6.1 神经功能评分

采用Berderson评分法测定针刺前后各组大鼠神经功能缺损程度。轻抓尾巴,提高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分为无神经功能缺损;1分为脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲,肩内收屈曲;2分为上述体征加上向麻痹侧推阻力下降;3分为活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状);4分为不能自发行走,意识丧失。

1.6.2 血清TNF-a、IL-6含量测定

针刺治疗1 d、3 d、7 d时间点结束后,给予水合氯醛麻醉,将其固定在解剖板上,剪去心前区被毛,消毒后开胸经心脏取血置于离心管中,静置2 h,5000转/min离心10 min,分离血清,置﹣20℃冰箱中备检。采用酶联免疫吸附法(Elisa)进行TNF-a、IL-6测定,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

所有数据均采用均数±标准差表示,全部数据采用SPSS18.0统计分析软件进行数据处理,组间比较采用方差分析,多重比较用或者法,以＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

各组均出现不同程度病灶对侧的偏瘫,爬行时向右侧划圈,病灶对侧前肢屈曲回收于腹下,瘫痪的后肢向后外展。在1 d时各组大鼠神经功能缺损最为严重,大部分大鼠有追尾现象或表现病灶对侧肢体不能站立,之后神经功能缺损程度逐渐减轻。与模型组比较,针刺组大鼠神经功能缺损征有明显恢复,在1 d和3 d神经功能评分均有显著差异(＜0.01),7 d有统计学意义(＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损体征评分比较 (±s,分)

表1 各组大鼠神经功能缺损体征评分比较 (±s,分)

组别n1 d3 d7 d 假手术组80.00±0.000.00±0.000.00±0.00 模型组83.08±0.231)2.58±0.151)2.33±0.191) 针刺组82.00±0.172)1.92±0.202)1.50±0.153)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01,3)＜0.05

2.2 各组大鼠血清中TNF-a含量比较

造模后,各时间点血清中TNF-a含量较假手术组明显增高,其中模型组在1 d、3 d、7 d时间点与假手术组比较差异有统计学意义(＜0.01)。经过针刺治疗后,同一时间点的针刺组大鼠血清中TNF-a含量明显下降,针刺组与模型组相比较,1 d、3 d、7 d时间点差异显著(＜0.01)。说明针刺可以降低脑出血大鼠血清的TNF-a含量。详见表2。

表2 各组大鼠血清中TNF-a含量比较 (±s,ng/L)

表2 各组大鼠血清中TNF-a含量比较 (±s,ng/L)

组别n1 d3 d7 d 假手术组81.34±0.461.89±0.201.41±0.21 模型组83.13±0.401)3.56±0.701)3.21±0.311) 针刺组81.93±0.532)2.41±0.702)2.18±0.702)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.3 各组大鼠血清中IL-6含量比较

造模后,各组大鼠血清中IL-6含量明显增高,模型组与假手术组在各时间点比较差异具有统计学意义(＜0.01)。针刺治疗后,针刺组与模型组相比较,同一时间点的针刺组大鼠血清IL-6含量明显下降,各时间点比较,差异有统计学意义(＜0.01)。说明针刺可以降低脑出血大鼠血清的IL-6含量。详见表3。

表3 各组大鼠血清中IL-6含量比较 (±s,pg/L)

表3 各组大鼠血清中IL-6含量比较 (±s,pg/L)

组别n1 d3 d7 d 假手术组821.56±0.6022.90±0.2321.61±0.59 模型组830.79±0.901)35.02±0.161)30.81±0.261) 针刺组822.59±0.552)25.67±0.602)23.76±0.242)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

4 讨论

脑出血发病机制目前尚未明确,但与动脉粥样硬化、炎症反应、血脂代谢紊乱、凝血机制异常等因素有关。近年来,炎性反应在脑出血病理生理机制中起着重要作用。急性脑出血的病理损伤除局部血肿占位性效应及对周围脑组织的直接破坏作用外,局部和全身炎症反应是继发性脑损伤的主要组成部分。

炎性因子与脑出血病情发展呈正相关[3],TNF-a和IL-6是两个重要的炎性因子。IL-6可由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞产生并作用于多种细胞,有广泛的生物学活性,因此参与多种疾病的病理过程,如心肌梗死、糖尿病等[4-5]。脑出血后血肿周围脑组织中IL-6水平增加,提升炎症反应加重,回归分析表明血清中IL-6水平是早期脑出血临床症状加重的独立因素。Dziedzic T等[6]发现脑出血患者血清IL-6和C反应蛋白水平升高,血清IL-6水平越高,患者的预后越差。TNF-a是由单核巨噬细胞和内皮细胞产生的具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子,通过抑制纤溶反应及活性蛋白C的抗凝作用,刺激内皮细胞释放白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1),通过与IL-1协同使内皮细胞表面呈促凝状态,从而促进血栓形成,加重脑血管疾病风险[7]。国内外研究也表明,TNF-a的高表达是造成脑出血后血管源性水肿形成的重要原因之一[8-9]。急性脑出血后,血肿周围组织及血清中TNF-a的表达都显著增强,提示TNF-a在急性脑出血的炎症反应和脑水肿发展中发挥重要作用[10-11]。

本实验采用Berderson神经体征评分法测定大鼠神经功能缺损程度,结果显示1 d时各组大鼠神经功能缺损最重,多数大鼠有追尾现象或表现为病灶对侧肢体不能站立,之后神经功能缺损程度逐渐减轻。与模型组比较,针刺组大鼠神经功能缺损征有明显改善,其各时间段的神经功能评分均具有统计学意义,说明针刺能显著改善脑出血大鼠神经功能缺损评分结果,减轻神经功能缺损症状。造模成功后,模型组大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量在1 d后开始增加,说明大鼠脑出血后炎性反应的存在,并且模型组血清中TNF-a及IL-6的含量与假手术组比较明显增高,亦说明脑出血后脑组织中炎症反应增加。针刺治疗后,针刺组大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量较模型组减低,1 d、3 d、7 d时间点差异具有统计学意义,说明针刺能够有效下调脑出血大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,由此,我们推断针刺能够减轻脑出血后血清中TNF-a及IL-6的含量,从而减轻脑出血后炎性反应所引起的不良后果,从而达到减轻脑损伤的作用。

综上,针刺百会透曲鬓能够有效降低神经功能评分,改善神经功能缺损的症状,可能与针刺后通过下调大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,从而减轻脑出血后炎性反应有关。

[1] 张国威,邹伟,刘芳,等.针刺对脑出血急性期大鼠脑损伤及脑水肿拮抗作用的机理研究[J].针灸临床杂志,2010,26(5):46-50.

[2] Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M,Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990,21(5):801-807.

[3] 张健,陈干涛.急性脑出血患者IL-6和 TNF-a水平与预后的关系[J].实用癌症杂志,2012,27(6):652-657.

[4] Vakili H, Ghaderian SM, Akbarzadeh NR,. Genetic polymer- phism of interleukin-6 gene and susceptibility to acute myocardial infarction[J]. Coron Artery Dis, 2011,22(5):299-305.

[5] Koh SJ, Jang YS, Hyun YJ,. Interleukin-6 (IL-6) -572C/G promoter polymorphism is associated with type 2 diabetes risk in Koreans[J]. Clin Endocrinol (Oxf), 2009,70(2):238-244.

[6] Dziedzic T. Clinical significance of acute phase reaction in stroke patients[J]. Front Biosci, 2008,13:2922-2927.

[7] Veréb Z, Lumi X, Andjelic S,. Functional and molecular charac- terization of ex vivo cultured epiretinal membrane cells from human proliferative diabetic retinopathy[J]. Biomed Res Int, 2013,2013: 492376.

[8] 崔向宁,李玉波,李妍.活血、利水中药对脑出血大鼠脑组织肿瘤坏死因子-a、核转录因子-kB及水通道蛋白-4表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2012,32(2):203-208.

[9] Musumeci M, Sotgiu S, Persichilli S,. Role of SH levels and markers of immune response in the stroke[J]. Dis Markers, 2013, 35(3):141-147.

[10] 王兴池.急性脑出血患者血清ICAM-1和TNF-a水平测定及分析[J].山东医药,2011,51(51):66-67.

[11] 刘振华,张清华,赵佳丽,等.血肿穿刺清除术对大鼠脑出血灶周组织中IL-6、TNF-a表达的影响[J].山东医药,2012,52(34):30-31.

Effect of Acupuncture on Serum TNF-aand IL-6 Contents in Cerebral Hemorrhage Rats

CHEN Qiu-xin1, ZOU Wei2, NIU Ming-ming1, LIU Peng1, YAO Dong1, BAO Yu1, SUN Xiao-wei2.

1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine First Hospital,Harbin 150040,China

Objective To investigate the effect of acupuncture on motor function and serum expressions of TNF-aand IL-6 contents in cerebral hemorrhage rats. Method Seventy-two male Wistar rats were randomized into sham operation, model and acupuncture groups. A rat model of cerebral hemorrhage was made by intracerebral injection of autoblood. Baihui-to-Qubin acupuncture was performed after successful model making. The TNF-aand IL-6 contents of rat serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay at three time points: one, three and seven days. Result Baihui-to-Qubin acupuncture markedly increased the neurological function score and reduced neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. At the same time point, serum TNF-aand IL-6 contents were significantly lower in the acupuncture group of rats than in the model and acupuncture group; there were statistically significant differences (＜0.01). Conclusion Baihui-to-Qubin acupuncture can reduce neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. It may be related to decreases in serum TNF-aand IL-6 contents after acupuncture.

Acupuncture; Tumor necrosis factor; Interleukin-6; Cerebral hemorrhage; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.10.1006

1005-0957(2015)10-1006-03

国家自然科学基金项目(81273824)

陈秋欣(1985 - ),女,2012级博士生,Email:chenqiuxin0451 @163.com

邹伟(1965 - ),男,教授,Email:kuangzou2013@sina.com

2015-02-20