肝癌组织中miR-200和Notch1蛋白表达的相关性

江小梅 彭杰文 (中山市人民医院化疗科，广东 中山 528400)

小分子RNA(miRNA)对生命体的生长发育、增殖分化等基本生物学行为起着关键的调控作用，而其失衡表达亦可促进多种人类疾病尤其是肿瘤的发生发展，而且，一些miRNA在肿瘤发生的过程中本身即被认为担当了癌基因或者抑癌基因的角色。miR-200与肝癌的发生及侵袭行为相关，可能发挥抑癌基因的功能。然而其发挥作用的机制目前尚不明确。本文通过对miR-200和Notch1蛋白表达进行相关性分析，初步探讨Notch1蛋白是否为miR-200发挥肿瘤抑制作用的重要靶点。

1 材料与方法

1.1 标本收集 收集2008年1～12月间中山大学第一附属医院肝胆外科和中山市人民医院肝胆外科手术患者肝癌组织标本和配对癌旁组织标本共36例，术前均未作放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗，每例标本均经病理医师诊断为恶性肿瘤。所有标本手术切除后，置入液氮中－80℃保存备用。

1.2 分组 根据美国癌症联合委员会(AJCC)与国际抗癌联盟(UICC)联合制定的TNM分类及临床分期，将上述病例分为:(1)临床分期:Ⅰ期9例;Ⅱ期12例;Ⅲ期15例;Ⅳ期病例数少，统归于Ⅲ期。(2)根据术前超声、CT、术中探查情况、术后组织学检查等分为:转移组19例;非转移组17例。

1.3 实时定量RT-PCR检测miR-200表达 取肝癌标本100 mg，研磨成组织浆，采用TriZol试剂一步法提取总RNA;采用DU800型紫外分光光度计进行RNA浓度测定，对样品浓度进行50倍稀释，测定其光吸收值。逆转录合成cDNA，行定量PCR检测;利用7500定量PCR仪所配SDS软件分析数据。

1.4 Western印迹法检测肝癌组织Notch1蛋白表达 称取肝癌标本100 mg，提取总蛋白，吸取30 μg，加凝胶加样缓冲液，煮沸10 min后上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;电转移法将蛋白转移至PVDF膜，甲醇固定，含5%脱脂奶粉的封闭液4℃过夜。一抗稀释度为 1∶1000室温孵育2 h，二抗稀释度为1∶2000室温孵育2 h后，ECL化学发光试剂盒处理并暗室显影。以β-actin为内参照。运用Quantitive one软件分析图像，Notch1条带与β-actin条带的积分密度比值表示其蛋白水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行方差分析和t检验，相关性采用Spearman等级相关检验。

2 结果

2.1 miR-200在肝癌组织中表达 miR-200在肝癌组织中表达量比在癌旁组织中表达低(2.83%vs 8.13%，P＜0.01);在不同临床分期标本的表达随着临床分期的增加而减少(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表达量分别为6.67%、3.89%、1.54%，P＜0.01);在转移癌组织中的表达量比非转移癌组织中低(1.83%vs 4.21%，P＜0.01)。

2.2 Notch1蛋白肝癌组织中表达 Western印迹检测肝癌组织中Notch1蛋白表达，采用GAPDH作为内参照，目的蛋白和内参基因蛋白均获得单一清晰条带。结果显示Notch1蛋白在癌旁组织、非转移癌组织、转移癌组织中的表达依次增加，差异显著(P＜0.05)。见图1。

2.3 Notch1蛋白表达和miR-200表达的相关性 Notch1蛋白表达和miR-200表达呈负相关(r=－0.684，P＜0.01)。

图1 Notch1蛋白在转移癌和非转移癌组织中的表达

3 讨论

大约70%～80%的HCC病人在晚期发现，一般经诊断后平均存活期为6个月，未经治疗的病人5年生存率＜3%。尽管近年来随着原发性肝癌早期诊断、早期治疗和肝外科的进展，以手术切除为主，联合全身化疗、肝动脉栓塞化疗、放疗、免疫治疗及中医中药等综合疗法，使肝癌的总体疗效显著提高，但是，肝癌的复发和转移使得肝癌的治疗难以取得较为理想的效果。小分子RNA的深入研究对于阐明肿瘤的发病机制及肿瘤的靶向治疗有重要的意义，为中晚期肝癌患者的治疗及改善肝癌患者的预后，提供新的途径和希望。

本研究提示miR-200与肝癌的发生及侵袭行为相关，可能发挥抑癌基因的功能。然而，miR-200发挥作用的机制目前尚不明确。研究表明，miRNA可通过调控其靶基因参与的信号通路，影响肿瘤的发生和发展，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能，是肿瘤基因治疗的新靶点〔1，2〕。如:miR-21可通过下调抑癌基因PTEN，从而促进肝癌的增生、迁移和侵袭;低表达肝癌细胞系中miR-21后，则PTEN表达增加，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱;过表达肝癌细胞系中miR-21后，肝癌细胞其迁移潜能显著增强〔3〕。研究表明，miRNA对靶基因的调控是在转录后水平上，通过对靶基因转录体的切割或对其翻译抑制两种机制来下调靶基因的表达。这两种机制的选择主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，如果miRNA与靶基因转录体信使RNA有充分的互补，miRNA将通过切割方式来调控靶基因;如果miRNA与靶基因转录体信使 RNA没有充分的互补，但有多个互补位点，那miRNA将通过翻译抑制的方式来调控靶基因〔4，5〕;并且对靶基因翻译的抑制需要多种 miRNA对同一靶基因的协同作用。在动物体内，大部分 miRNA不能与靶基因的转录体完全配对，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因〔6〕。

miRNA靶基因的鉴定能为确定miRNA的功能提供直接证据，因此，寻找及鉴定新的miRNA癌基因或抑癌基因是干预肿瘤发生发展的关键。然而miRNA靶标基因的鉴定本身也是一个研究难点。植物的miRNA与靶基因几乎完全配对结合，所以植物的miRNA靶基因鉴定相对直接和容易〔7〕。在动物中，miRNA与靶基因mRNA以不精确的碱基互补配对结合于3'端非翻译区(3'-UTR)。另外，miRNA又是大约22 nt的小分子，所以单纯通过序列相似性来鉴定动物体内的miRNA结合位点是相当困难的〔8〕。目前，有多个研究小组独立开发了多种miRNA靶基因预测软件〔9～10〕，利用生物信息学方法预测的miRNA的靶基因，如果加上miRNA的亚细胞定位，两者结合可大大提高miRNA靶基因鉴定效率。

Notch1信号在肿瘤的发生和演进过程中有着重要作用。紊乱的Notch1信号不仅能够直接引起肿瘤的发生，而且它可通过与其他多条信号通路的交互作用，以间接的方式最终诱导肿瘤形成。新的研究结果表明，Notch1主要在肝癌组织的胞质中表达，表达明显高于癌旁组织中的表达，与我们的研究结果一致〔11〕;Notch1蛋白可调节Jurkat和HepG2细胞增殖，抑制其表达可抑制肿瘤细胞增殖〔12〕;下调Notch1的表达可引起肝癌细胞生长抑制和诱导肝癌细胞凋亡〔13〕;组成性活化Notch1可通过抑制蛋白酶降解而上调肝癌p53蛋白表达，Notch1蛋白可通过抑制Akt/Hdm2介导的p53降解以及上调p53依赖DR5表达，从而增加肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性〔14〕;胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)的活化可导致天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶(AAH)和Notch1蛋白的过表达，从而使肝癌具有恶性表型〔15〕。最新的研究表明，下调miR-34a，miR-127及miR-16a表达，可靶向调控 E2F3，Notch1，BCL6，ZFHX1B 和BCL2蛋白表达水平，通过调节细胞凋亡、细胞增殖、细胞间连接以及上皮间质转化等机制促进肝癌的发生发展〔16〕。

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7 Rhoades MW，Reinhart BJ，Lim LP，et al.Prediction of plant microRNA targets〔J〕.Cell，2002;110(4):513-20.

8 Lewis BP，Shih IH，Jones-Rhoades MW，et al.Prediction of mammalian microRNA targets〔J〕.Cell，2003;115(7):787-98.

9 Sethupathy P，Megraw M，Hatzigeorgiou AG.A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets〔J〕.Nat Methods，2006;3(11):881-6.

10 Sethupathy P，Corda B，Hatzigeorgiou AG，et al.Tarbase:a comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets〔J〕.RNA，2006;12(2):192-7.

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15 Cantarini MC，de la Monte SM，Pang M，et al.Aspartyl-asparagyl beta hydroxylase over-expression in human hepatoma is linked to activation of insulin-like growth factor and notch signaling mechanisms〔J〕.Hepatology，2006;44(2):446-57.

16 Tryndyak VP，Ross SA，Beland FA，et al.Down-regulation of the microRNAs miR-34a，miR-127，and miR-200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet〔J〕.Mol Carcinog，2009;48(6):479-87.