KDM1A对胃癌侵袭转移能力的影响

徐丽伟+丁杰

[摘要] 目的 在组织和细胞水平探讨KDM1A的表达水平，并分析其对胃癌侵袭转移的影响。 方法 通过Western Blot技术检测胃癌组织及胃癌细胞中KDM1A蛋白的表达；通过Transwell侵袭实验检测胃癌细胞的侵袭性；利用RNA干扰技术抑制胃癌细胞BGC823中KDM1A的表达。 结果 在胃癌组织及胃癌细胞株中KDM1A蛋白质表达升高；胃癌细胞的侵袭转移能力与KDM1A 蛋白表达量之间均存在正相关关系；siRNA-KDM1A可在体外干扰胃癌细胞BGC823中KDM1A蛋白表达，并影响BGC823的侵袭转移能力。 结论 KDM1A在胃癌组织及细胞中表达上升，在体外实验中抑制KDM1A表达，可抑制胃癌细胞的侵袭转移。

[关键词] 胃肿瘤；KDM1A基因；侵袭转移

[中图分类号] R273.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）23-0001-04

The impact of KDM1A on the invasion and metastasis of gastric cancer

XU Liwei1 DING Jie2

1.Department of Thoracicta Tumor Surgery， Tumor Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery， Guizhou People's Hospital， Guiyang 550002， China

[Abstract] Objective To explore the expression level of KDM1A in tissues and cell lines， and to analyze its impact on the invasion and metastasis of gastric cancer. Methods Used western blot to detect KDM1A protein expression in gastric cancer tissue and gastric cancer cell lines. Used transwell invasion assey to detect gastric cancer cell lines in vitro. Used RNA interference technique to silence KDM1A in gastric cancer cell line BGC823. Results There was higher KDM1A protein expression in gastric cancer tissues and cell lines. There was positive correlation between protein KDM1A expression and invasive and metastatic ability of gastric cancer cell lines. siRNA-KDM1A interfered BGC823 KDM1A protein expression in gastric cancer cells in vitro， and affected BGC823 ability of invasion and metastasis. Conclusion There is higher KDM1A expression in gastric cancer tissues and cell lines， and the decrease of KDM1A expression inhibits the invasion and metastasis in vitro.

[Key words] Gastric cancer； KDM1A genes； Invasion and metastasis

长期以来，世界范围内，胃癌在肿瘤疾病中发病率居高不下，发病年龄主要集中于40～60岁，男女比例约为2∶1。胃癌转移复发是影响胃癌患者预后的主要因素之一，因胃癌早期自觉症状不易引起重视，而我国胃癌全民普查机制尚未完善，故此初诊时部分患者病情已至进展期。进展期胃癌患者术后出现转移复发可能性高，预后及生活质量均不理想。因此众多研究者将目光投向胃癌侵袭转移机制研究，以期为胃癌的治疗提供新思路、新方法，提高肿瘤患者的生存期。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（KDM1A）位于人类1号染色体短臂3区6带12亚带。KDM1A是第一个被定义的组蛋白特异性去甲基化酶，能够特异性的去除组蛋白H3第4位及第9位赖氨酸的一甲基及二甲基化，实验发现[1]KDM1A在多种肿瘤组织及细胞中表达升高，如前列腺癌[2-4]、乳腺癌[5-7]、膀胱癌[8，9]、结直肠癌[10]、肺癌[11]及中枢神经系统肿瘤[12]。KDM1A可能参与多条信号通路，影响了肿瘤发生、生长、增殖、侵袭转移等多个环节[4，13-15]。本实验将在组织及细胞水平探讨KDM1A在的表达，并通过RNA干扰技术抑制KDM1A的表达，分析其对胃癌细胞增殖侵袭的影响。

1 资料与方法

1.1 组织标本

收集2012年6月～2013年1月于中南大学湘雅医学院行手术切除的胃癌及癌旁标本40对，液氮保存。通过电子病历系统查询患者性别、年龄、分期等情况。按国际抗癌联盟（UICC）的TNM标准，进行病理分期，患者术前未实施辅助化疗，均签署知情同意书。

1.2 实验材料

胃癌细胞株AGS、SGC7901、BGC823及人胚胃上皮细胞GES1，均购自中南大学湘雅医学院细胞研究中心。KDM1A单克隆抗体购于美国Abcom公司，GAPDH单克隆抗体购于美国SANTACRUZ公司，总蛋白抽提试剂盒购于美国ProMab公司，Western Blot试剂盒购于东阳纺生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 GES-1：培养条件：DMEM培养基，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃。AGS：培养条件： F-12培养基，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃。SGC-7901：培养条件：RPMI-1640培养基，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃。BGC-823：培养条件：RPMI-1640培养基，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃。

1.3.2 Western Blot实验 利用总蛋白抽提试剂盒提取总蛋白，BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白质浓度，取40 μg蛋白上样，200 V恒压电泳，SDS-PAGE分离，300 mA恒流、4℃转膜， 约70 min，5%PBS 37℃封闭2 h，分别加入兔抗人KDM1A单克隆抗体（1∶1 000）及鼠抗人GAPDH 单克隆抗体（1∶800），4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，分别加入羊抗兔及羊抗鼠HRP单克隆抗体（1∶80 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，加底物，做化学发光，得到胶片。对于培养细胞，每实验组设置3个平行样本，计算均值及方差。

1.3.3 体外Transwell实验检测胃癌细胞侵袭性 实验所用细胞包括三种胃癌细胞株（AGS、SGC7901、BGC823）及人胚胃上皮细胞株GES1。细胞悬液制备：以胰蛋白酶消化各实验组细胞，以PBS漂洗3次，以各株细胞对应的无血清培基调节细胞密度，约1×104个细胞/mL。细胞接种：Transwell上室接种制备好的细胞悬液约2 mL，Transwell下室加入以各株细胞对应的含血清培基，以各株细胞对应的培养条件培养约24 h。细胞计数：除去基质胶和上室内的细胞，酒精固定，苏木素染色，倒置显微镜观察计数。实验组于倒置显微镜下随机观察3个视野，计算均值及方差。

1.3.4 siRNA-KDM1A构建 在GenBank中检索人源KDM1A序列，KDM1A的基因信息为：NM_001009999.2，Homo sapiens lysine （K）-specific demethylase 1A （KDM1A），transcript variant 1， mRNA，并设计KDM1A mRNA 的siRNA：

正义链5-CCGGAUGACUUCUCAAGAATT-3，反义链5-UUCUUGAGAAGUCAUCCGGTT-3。

以上目标序列由上海吉玛制药技术公司合成。同时合成阴性对照序列KDM1A negative control：正义链 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反义链5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.3.5 细胞转染（LipofectamineTM 2000） 细胞预处理： 将约1×105个细胞接种于0.5 mL去双抗培养基，按培养条件，培养24 h后观察细胞密度，约为50%。细胞转染：分别用250 μL Opti-MEM稀释siRNA-KDM1A、siRNA-NC及转染试剂，而阴性对照组只以250 μL Opti-MEM稀释转染试剂，加入混合后室温孵育约25 min，取混合物加入实验孔中，每孔100 μL。观察计数：混匀后按培养条件，培养6 h，于倒置荧光显微镜下观察转染效率，培养48 h后，进行后续实验。

1.4 统计学方法

使用STATA/MP13.0统计软件进行统计学分析。使用t检验对连续数据进行组间均数比较，F检验进行方差分析，Bonferroni方法进行多组间两两比较，Spearman秩相关分析进行相关性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床病理特征

实验标本为40对胃癌及癌旁组织，来自随机自愿参加实验的40例患者。40例患者包括男24例，女16例。年龄最大者为71岁，年龄最小者为37岁，平均（51.3±7.8）岁。根据UICC的TNM分期标准（2010年第7版），Ⅰ期患者4例，Ⅱ期患者13例，Ⅲ期患者21例，Ⅳ期患者2例。

2.2 KDM1A 蛋白在胃癌及癌旁组织中的相对表达量

以Western Blot方法检测胃癌及癌旁组织中KDM1A的相对表达，经t检验，两者之间具有统计学差异（t=16.15，P<0.05），胃癌组织中KDM1A蛋白相对表达量（0.67±0.18）高于癌旁组织（0.19±0.05）。见封三图1A。

2.3 KDM1A蛋白在胃癌细胞中的相对表达量

以Western Blot方法检测人胚胃上皮细胞株GES1及三种胃癌细胞株（AGS、SGC7901、BGC823）中KDM1A的相对表达。KDM1A 蛋白相对表达量在四种细胞中分别为：GES1：0.26±0.08；AGS：0.43±0.09；SGC7901：0.57±0.25；BGC823：0.86±0.12。经F检验，四组之间具有统计学意义（F=8.06，P<0.05）。见封三图1B～C。

2.4 胃癌细胞侵袭能力检测

以Transwell实验检测人胚胃上皮细胞株GES1及三种胃癌细胞株（AGS、SGC7901、BGC823）的侵袭转移能力。在每个随机视野中，四株细胞穿膜细胞数分别为GES1：26.0±2.0；AGS：43.2±2.5；SGC7901：81.4±5.6；BGC823：112.1±3.5。经F检验，四组穿膜细胞数不完全相等（F=331.91，P<0.05）。见封三图1D。

2.5 KDM1A的表达与细胞侵袭性的相关性分析

经Spearman秩相关分析，在四株细胞中，穿膜细胞数与KDM1A蛋白表达量之间呈正相关（r=0.89，P<0.05）。

2.6 siRNA-KDM1A对胃癌细胞BGC823中KDM1A表达的影响

以Western Blot法检测siRNA-KDM1A组、siRNA-NC组及阴性对照组中KDM1A蛋白质表达。在三个实验组中，KDM1A相对表达量分别为阴性对照组：0.71±0.17；siRNA-NC组：0.78±0.09；siRNA-KDM1A组：0.10±0.05。经F检验，三组之间KDM1A表达量不完全相等（F=31.88，P<0.05）。siRNA-KDM1A组表达量低于siRNA-NC组（t=-0.68，P<0.05）、阴性对照组（t=-0.60，P<0.05），而siRNA-NC组与阴性对照组之间无统计学意义（t=0.07，P>0.05）。见封三图1E。

2.7 siRNA-KDM1A对胃癌细胞BGC823侵袭性的影响

siRNA-KDM1A转染胃癌细胞BGC823后，使用Transwell方法检测siRNA-KDM1A组、siRNA-NC组及阴性对照组中细胞的侵袭能力。在每个随机视野中，三个实验组穿膜细胞数分别为阴性对照组118.6±4.0；siRNA-NC组：122.3±8.3；siRNA-KDM1：59.6±3.7。经F检验，三组之间穿膜细胞数目不完全相等（F=111.32，P<0.05）。siRNA-KDM1A组穿膜细胞数低于siRNA-NC组（t=-62.67，P<0.05）、阴性对照组（t=-59，P<0.05）；siRNA-NC组与阴性对照组之间无统计学意义（t=3.67，P>0.05）。见封三图1F。

3 讨论

通过实验结果可以发现，KDM1A蛋白相对表达量在胃癌组织中高于癌旁组织，体外实验也证明，胃癌细胞中KDM1A蛋白相对表达量也高于正常胃上皮细胞。同时，体外侵袭实验证明在胃癌细胞中KDM1A高表达预示着更强的侵袭转移能力，而利用RNA干扰技术抑制KDM1A表达后，胃癌细胞侵袭能力减弱。

既往的研究已证实，KDM1A在多种上皮来源肿瘤中高表达，这种表达增高预示着更差的预后生存期[21]。导致这种现象的原因可能是KDM1A参与多条信号通路，影响了肿瘤发生、生长、增殖、侵袭转移等多个环节[4，13-15]。肿瘤侵袭转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一，也是临床肿瘤患者的主要死因。KDM1A表达增高使肿瘤细胞侵袭转移能力增强，具体作用机制是多样的，主要通过与其他因子构成复合体结合于基因启动子区，改变基因启动子区甲基化状态而改变基因表达[7，13，16-19]。

KDM1A可与多种因子结合而调节下游基因表达，如Snai1[17]、Slug[18]、JARID1B/NuRD[16]等。Snai1指蛋白转移因子家族在上皮间质转化中充当了调节介质的作用，Snai1能够抑制上皮型蛋白表达（如E-钙粘蛋白），从而促进上皮间质转化的进行。Snai1可招募KDM1A于上皮表型基因启动子区。在侵袭性肿瘤细胞中KDM1A对Snai1介导的转录抑制及维持Snai1靶基因沉默状态十分重要。若KDM1A表达沉默则Snai1无法抑制E-钙粘蛋白表达。在E-钙粘蛋白表达沉默的肿瘤细胞中，若KDM1A耗尽E-钙粘蛋白启动子区H3K4me2水平上升，而且部分上皮型基因表达上升。这些可能表明KDM1A在上皮间质转化相关的肿瘤侵袭中发挥重要作用[17]。Slug亦可招募KDM1A于BRCA1基因启动子区E-boxes，而抑制BRCA1表达[18]。KDM1A可与JARID1B/NuRD形成复合体起到转录抑制的作用，全基因组转录分析证实上皮趋化因子CCL14[13]及TGFbeta1[16]信号通路均受到此复合体的调控。CCL14表达受到抑制后造成乳腺癌细胞血管生成及侵袭能力减弱，而TGFbeta1则与乳腺癌细胞生长增殖及上皮间质转化有关。

此外，KDM1A可通过特异性去除p53第370位赖氨酸甲基抑制p53介导的细胞凋亡，促进细胞增殖[19]。同时可促进BCL2及c-myc表达，抑制细胞凋亡，促进细胞分裂[20，21]。

因KDM1A中包含一个胺氧化酶（amine oxidase like，AOL）结构域，故一些已合成的或已应用于临床的单胺氧化酶抑制剂可抑制KDM1A的催化活性，如丙炔甲基苄胺[9]、苯乙肼[22]、反苯环丙胺等[23]。而KDM1A被抑制后，肿瘤细胞的侵袭转移能力降低，因此，有研究者认为KDM1A拥有成为治疗靶点的潜能。

本研究的局限在于仅选取了同一所临床医院、同一时期内的40对临床标本，取样范围、时间较局限，总样本量较少，可进一步延长实验跨度、扩大样本，明确KDM1A与胃癌临床病理特征之间的关系。在体外实验中，仅对KDM1A表达量较高、侵袭性较强的胃癌细胞株BGC823进行了RNA干扰实验，而针对其他多种胃癌细胞株的干扰实验可更全面地了解KDM1A对胃癌侵袭转移能力的影响。

综上所述，KDM1A在胃癌组织及细胞中表达上升，在体外实验中抑制KDM1A表达，可抑制胃癌细胞的侵袭转移。KDM1A有可能成为肿瘤治疗的新靶点。

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（收稿日期：2015-04-08）