反相超效液相色谱—质谱联用分离分析食用油中的甘油三酯

何榕　山晓琳　董方圆　许旭

摘 要 采用反相超效液相色谱-质谱联用的方法分离分析食用油中的甘油三酯。使用总长40 cm的串联超效C18色谱柱（10 cm+ 15 cm+ 15 cm），以乙腈-异丙醇（50∶50， V/V）为流动相，流速0.2 mL/min， 柱温25℃，在大约74 MPa的高柱压下分离，APCI离子化-质谱检测。食用油以异丙醇溶解后直接进样。实现了对食用油中甘油三酯组分的更精细区分，获得了玉米油、大豆油、花生油、葵花籽油、稻米油、橄榄油和芝麻油等市售食用油中甘油三酯组成的谱图。结果显示，甘油三酯在相同食用油中的组成相似，而在不同食用油中的组成存在差异。采用本方法，通过差异的色谱峰可直接识别出大豆油中掺入的5%猪油。本方法为识别掺假食用油提供了有价值的途径。

关键词 反相超效液相色谱-质谱联用； 甘油三酯； 食用油

1 引 言

三脂肪酸甘油酯（甘油三酯）由1个甘油分子与3个脂肪酸分子结合成酯而成，是食用油的主要成分。根据碳链的长度以及不饱和度，脂肪酸的种类可高达800余种。动物及植物油脂主要集中在含有0～3个双键的C8～C26的直链脂肪酸，同时由于结合位置的不固定，导致了甘油三酯的种类相较脂肪酸更趋向于复杂多样[1]。但常见动物油和植物油中主要存在的仅是含有C16和C18的甘油三酯，如脂肪酸为棕榈酸（C16∶0，P）、硬脂酸（C18∶0，S）、油酸（C18∶1，O）、亚油酸（C18∶2，L）、亚麻酸（C18∶3，Ln）的甘油三酯。其它脂肪酸的甘油三酯含量普遍较低。

目前，在世界范围内广泛存在着食用油掺杂的问题，在中国尤以地沟油掺杂问题备受关注[2～4]，甘油三酯作为食用油的主要成分，对其进行分离分析是一个值得关注的研究方向。高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）在分离分析甘油三酯方面具有独特的优势，不同的液相色谱柱可以对甘油三酯形成不同程度的分离，高灵敏质谱检测器为分离后的定性识别与定量分析提供了重要条件。目前，用于分析甘油三酯的质谱离子源有ESI与APCI两种离子源。ESI源适用于检测中等极性以及强极性的化合物，在使用ESI源时可利用多级质谱通过将甘油三酯分子打碎后得到的子离子峰，获得对甘油三酯更好的定性分析结果[5，6]。通常使用ESI源时需要在流动相中加入盐类才会有好的离子化效果[7～9]。APCI源适用于弱极性化合物的检测，甘油三酯在APCI源中主要形成3种类型的碎片离子： 酰基离子（RCO）+、单酰基甘油离子（M+H-RCOOH-RCO）+和二酰基甘油离子（M+H-RCOOH）+，根据这些碎片离子峰的特征，可以确定甘油三酯的结构[10～13]。

本实验使用串联长柱建立了超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析食用油中甘油三酯组成的方法。与普通的HPLC分离相比，本方法可以简便地对食用油中的甘油三酯实现更精细的分离分析，从而可根据不同食用油之间甘油三酯的精细差异，区分常见食用油，并可检测掺入少量猪油的大豆油。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LCMS 2020型超高效液相色谱仪（日本 岛津公司）， 包括脱气机、两个LC-30AD泵、 CTO-30A 柱温箱、SIL-30AC自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器及使用APCI源的质谱检测器。数据分析软件采用LabSolution software （version 5.53）。

三油酸甘油三酯、乙腈（HPLC级）、异丙醇（HPLC级）均购自国药集团化学试剂有限公司。食用油样品除猪油为自制外，其它均购自本地超市。

2.2 实验方法

2.2.1 样品及其准备

（1）液体样品 移取10 μL样品溶于1000 μL异丙醇中，浓度为1%（V/V），直接进样。（2）固体样品 称取0.5 g溶解于50 mL正己烷中，浓度为1%（w/V），直接进样。

2.2.2 色谱与质谱条件

液相色谱条件：Thermo Syncronis C18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）与两根月旭Ultimate UHPLC XB-C18（150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）色谱柱串联。流速为0.2 mL/min，流动相为乙腈-异丙醇（50∶50， V/V）等度洗脱。进样量为1 μL。

质谱条件： APCI电离源， 正离子电离模式， 质荷比（m/z）范围300～1050， 雾化气流速2.5 L/min， 干燥气流速5 L/min， APCI温度250℃， DL温度250℃， Heat 温度200℃， 检测器电压1.05 kV。

3 结果与讨论

3.1 实验条件优化

使用单根C18超效柱（Thermo Syncronis C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm））玉米油的LC-MS分离总离子流谱图见图1A。其中有6个甘油三酯的峰，根据所得到的质谱图，推测出其主要的甘油三酯类型为峰1为LLLn；峰2可能包括LnSLn/LOLn/LLL；峰3包括PLL/POL/OLL，峰4包括POL/SLnO/OOL/SLL；峰5为POO/PLS/OOO/SLO/SLnS；峰6为SOO/SSL/POS。不同碳当量数（为碳数减去两倍双键数）的甘油三酯得到了很好的分离，但根据峰2，3，4，5，6可以推测，多种拥有相同碳当量数而双键数不同的甘油三酯依然无法分离。改用3根C18超效色谱柱串联分离玉米油得到的色谱图见图1B，原先未完全分离的峰2，3，4，5，6又分离出多个甘油三酯的峰。

由图1B可见，在玉米油中共分离出了13个峰，其中9个较大的峰可以根据其质谱图推测出其甘油三酯的结构，分别为：LLL，OLL，PLL，OOL，POL，PPL，OOO，POO，PPO。

考察流动相、温度以及流速对玉米油分离和柱压的影响（表1）。增加流动相中异丙醇的量可以减小保留时间，但分离（Rs为OOL与POL两峰之间的分离度）变差，系统的压力也较大；当流动相为40%异丙醇时，分离度很好且压力也较低，但出峰时间太长。温度增高， 保留变小，但分离度下降，显示降低温度有益于甘油三酯的分离。由于常温条件 （25℃） 下可以实现很好的分离，故本实验选择25℃。增大流速有利分离，但流速在0.25 mL/min时压力已达95 MPa，因而流速选择0.2 mL/min。endprint

综上所述，本实验选用UPLC的实验条件为：流动相为50%异丙醇、流速0.2 mL/min、柱温25℃，此时分离度约为3.82，系统压力约为74 MPa。

实验中，质谱条件APCI温度、DL温度及Heat 温度的改变对结果有较大影响，升高APCI源温度时， 信噪比很差； 温度降低则会不出峰。本实验直接选取仪器自动调谐后的APCI温度、DL温度以及Heat 温度进行实验。

3.2 重复性、线性关系与检出限

使用1%（V/V）三油酸甘油酯样品，按2.2节进行操作，并分别重复5次，计算得到1%（V/V）三油酸甘油酯组分峰面积的相对标准偏差（RSD）为4.9%。

使用2.2节方法分别配制浓度为0.05%～1%（V/V）的三油酸甘油酯样品进行分析，得到峰面积-浓度的线性方程为y=1.07×107+2.06×108x，相关系数0.9987。以0.01%（V/V）三油酸甘油酯为样品分析得到的信噪比（S/N）为5.48，显示本方法对三油酸甘油酯的检测限低于0.01%（V/V）。

3.3 食用油样品的分析

3.3.1 不同厂家玉米油的分析

图2显示了不同厂家玉米油的分析结果。从图2可见，相同的玉米油拥有相似的甘油三酯类型和含量，仅在某些峰的面积上存在细微差别。

3.3.2 不同种类食用油的分析 不同种类的食用油之间显示出一些明显的差异，如图2的玉米油与图3中的花生油、葵花籽油、稻米油、橄榄油和芝麻油，以及图4中大豆油的谱图。不同种类食用油之间

在甘油三酯得到精细分离后存在明显区别，其中橄榄油与其它食用油之间的区别最为明显，而大豆油与玉米油之间的区别最小。

放大玉米油和大豆油的总离子流谱图进行比较（图4）。可以看出，大豆油在保留时间22和29 min左右有两个峰明显大于玉米油相应位置的峰，其峰强度相差超过10倍。在27 min附近（图中虚线），玉米油有两个峰，而大豆油有5个峰；在35 min左右，玉米油和大豆油有相似的4个峰；在42～50 min，玉米油和大豆油都有明显的4个峰，但45 min的峰具有不同的面积（图中大豆油该峰的保留时间有少量延迟）。因此， 可以通过保留时间在22和29 min的峰识别两种相似的食用油。其它差异较大的食用油可以更容易地在图2、图3和图4中识别出特征。这为不同食用油的区分和识别提供了条件。

因此，可以认为，在对甘油三酯组分UPLC-MS精细分离的情况下，相同食用油之间甘油三酯组分的分布和含量差异不大，而不同食用油之间则存在可供识别的差异，其中动物油与植物油之间的差异很大。推测这种甘油三酯之间的差异可能与食用油来源的种属差异及其存在的酯酶差异有关。

3.4 玉米油/大豆油中掺杂猪油的检测

考虑到潲水油和劣质动物油两类地沟油中均会存在掺入动物油的情况，本研究利用动物油与植物油之间的明显差异，以常用的玉米油以及大豆油中加入不同比例的猪油为样品，采用2.2 节的方法对其进行分离分析，结果见图5。峰B和E在猪油中具有特征性，在玉米油和大豆油中通过比较峰A和B之间的高度比，选择峰高比A/B=1.0为指标，可以识别掺杂10%猪油。而通过比较玉米油中峰C和E的高度以及大豆油中D和E的高度，选择峰高比C/E=1.0和峰高比D/E=1.0为指标，在掺杂5%猪油时仍可看出与不含猪油的大豆油存在差异。选取100%玉米油中峰A和峰B的峰高的比值A/B、以及峰C和峰E的峰高比值C/E， 大豆油中同样选择A/B、以及峰D和峰E的峰高比值C/E， 计算的数据见表2。在玉米油中掺杂了猪油以后，无论是A/B还是C/E都会相应增加，且C/E增加的更多。豆油在掺杂了猪油后，同样的A/B和D/E也是有相应的增加，D/E增加的幅度也更大。因此，通过选择“峰高比为1.0”这个指标，可实现10%猪油掺杂玉米油的识别以及5%猪油掺杂大豆油的识别。因此，根据对不同食用油品种差异的研究，可通过建立特定食用油中掺入其它食用油的鉴别方法，实现对掺假食用油的准确识别。

4 结 论

采用3根超高效色谱柱串联的方法，使用UPLC-MS， 在高柱压下对食用油中的甘油三酯进行了分析。有文献提出增大柱压有利于脂类化合物分离[14]，本研究将3根色谱柱串联，也在高柱压的条件下获得了较好分离，由原来单根色谱柱的6个峰改进到串联后的13个峰，使拥有同分异构的部分甘油三酯也得到了分离。通过对不同厂家及不同种类食用油的分析，显示同种食用油之间的差别很小，而不同种类的食用油之间差异明显。对掺杂猪油的分析结果显示， 5%猪油掺杂大豆油可以被识别。

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