功能化Mn掺杂ZnS量子点用于人血清中IgG的低背景磷光检测

朱保砚　杨成雄　严秀平

摘 要 通过Mn掺杂ZnS量子点表面的羧基与人IgG表面的氨基进行酰胺缩合，制备了人IgG功能化的Mn掺杂ZnS量子点（IgG-QDs）。通过金纳米粒子和羊抗人IgG之间的静电相互作用，合成了羊抗人IgG功能化的金纳米粒子。利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金纳米粒子之间的荧光共振能量转移效应，建立了人血清中人IgG的室温磷光检测新方法。本方法的线性范围为1～10 μg/mL，检出限为0.45 μg/mL。由于引入了室温磷光检测，本方法有效避免了机体自发荧光和基质散射光等背景信号的干扰，成功实现了人血清样品中人IgG的检测。

关键词 Mn掺杂ZnS量子点； 免疫球蛋白G； 金纳米粒子； 磷光

1 引 言

量子点作为一种新型荧光探针，与有机荧光染料相比，具有吸收光谱宽、发射光谱窄和抗光漂白性好等优点，在诸多领域得到了广泛研究和应用[1～11]。而传统的荧光量子点用于生物传感时，常受到基体自发荧光和基质散射光的干扰[12]。因此，需要将量子点光信号和背景光信号区分开。目前已报道的可避免背景干扰的量子点主要有两类，近红外量子点[13～15]和磷光量子点[16～22]。近红外量子点的发射波长较长，可以避开发射波长在550 nm左右的背景信号干扰。磷光量子点由于发光寿命较长，可在发光时间上避开短寿命的背景信号干扰。

Mn掺杂ZnS量子点是磷光量子点的典型代表，其光学性质优异，在生物传感中具有良好的应用潜力。已有的基于Mn掺杂ZnS量子点的生物传感方法，大多依赖分析物与量子点之间直接[22]或者间接[21]的相互作用。IgG（免疫球蛋白G，IgG）是血清主要的抗体成分，在机体免疫中起保护作用，其指标对疾病诊断具有重要意义。IgG等生物活性蛋白与量子点并没有明显的相互作用，又需要保持其四级结构来执行生物学功能，开发基于Mn掺杂ZnS量子点的可用于人IgG等生物活性蛋白的低背景检测方法具有重要意义。

本研究通过Mn掺杂ZnS量子点表面的羧基与人IgG表面的氨基进行酰胺缩合， 制备了人IgG功能化的Mn掺杂ZnS量子点（IgG-QDs）； 通过金纳米粒子和羊抗人IgG之间的静电相互作用， 制备了羊抗人IgG金纳米粒子。利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金纳米粒子之间的荧光共振能量转移效应，构建了人体血清中人IgG的室温磷光检测新方法。本方法的线性范围为1～10 μg/mL，检出限为0.45 μg/mL。由于引入了室温磷光检测，本方法可有效避免基体自发荧光和基质散射光等背景信号的干扰。同时，由于引入了IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金纳米粒子之间的荧光共振能量转移效应， 因此本方法可用于高选择性检测生物体液中的人IgG。本方法低毒低背景，有望用于构建其它检测体系， 用于生物体液中的重要生物活性物质的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Rigaku D/max-2500 X-射线衍射光谱仪（日本理光公司）； Tecnai G2 F20高分辨场发射透射电子电镜（荷兰菲利普公司）； UV-3600紫外-可见-近红外分光光度计（日本岛津公司）； FL-4500荧光光谱仪（日本日立公司）。

所用试剂至少为分析纯。超纯水（电阻率18.2 MΩ cm）由WaterPro水纯化系统（美国Labconco 公司）制备。柠檬酸钠、巯基丙酸（MPA）和氯金酸（阿拉丁试剂）； 吐温-20、ZnSO4·7H2O、Mn（Ac）2·4H2O和Na2S·9H2O（天津市光复精细化工研究所）；C6H5Na3O7·2H2O（天津富辰化学试剂研究所）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），购于上海 Medpep公司；人IgG和羊抗人IgG （Ab，北京拜耳迪生物科技有限公司）；氨基酸和人血清白蛋白（HSA）购于北京普博欣试剂公司。

2.2 实验方法

2.2.1 Mn掺杂ZnS量子点的制备

参考文献[23]制备Mn掺杂ZnS量子点。在100 mL圆底三口烧瓶中加入0.5 mmol ZnSO4和0.02 mmol Mn（Ac）2，室温磁力搅拌混合均匀。加入2 mmol MPA，待搅拌均匀后用1.5 mol/L NaOH调至pH 11，以去离子水调节体系总体积至45 mL。室温磁力搅拌下通氩气30 min，在隔绝空气的条件下加入5 mL Na2S溶液（0.05 mmol/L）。反应20 min后，将体系敞开，并在50℃的恒温水浴中陈化2 h。以无水乙醇沉降所得量子点，离心（10000 r/min，10 min），再用无水乙醇洗涤沉淀两次，离心收集沉淀。所得沉淀室温真空干燥24 h，得到Mn掺杂ZnS量子点。

2.2.2 人IgG功能化Mn掺杂ZnS量子点（IgG-QDs）的制备

参考文献[24～26]制备人IgG功能化Mn掺杂ZnS量子点。用10 mmol/L PBS（pH 7.4）稀释人IgG原液，得到5.0 mg/mL人IgG溶液，备用。称取10 mg Mn掺杂ZnS量子点，4 mg EDC和2 mg NHS，溶解在1.0 mL 10 mmol/L PBS（pH 7.4）中。所得混合液在室温下磁力搅拌30 min，使Mn掺杂ZnS量子点表面羧基充分活化。向上述混合液中加入1.0 mL 5.0 mg/mL人IgG溶液，室温下磁力搅拌2 h。随后将反应液于4℃放置过夜，让未反应的EDC水解而失去活性。2500 r/min离心10 min，弃去上清液。将得到的沉淀用10 mmol/L PBS（pH 7.4）洗涤两次。随后将得到的沉淀溶解于20 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）中，于4℃放置备用。

2.2.3 金纳米粒子（AuNPs）的制备

参考文献[27～30]制备AuNPs。称取115 mg柠檬酸钠，以10 mL去离子水溶解， 得1%的柠檬酸钠溶液。在100 mL圆底烧瓶中加入25 mL去离子水和250 μL 1% 氯金酸溶液，磁力搅拌下加热至沸腾。向体系中快速加入1 mL 1% 柠檬酸钠溶液，反应2 min后，反应液由金黄色变为酒红色。待反应液保持沸腾10 min后撤去加热源，室温下搅拌15 min，得到所需的AuNPs溶液。

2.2.4 羊抗人IgG功能化AuNPs（Ab-AuNPs）的制备

参考文献[25]制备羊抗人IgG功能化的金纳米粒子。以0.1 mol/L Na2CO3溶液调节AuNPs溶液至pH 9.0，取此溶液10 mL，与300 μL 1 mg/mL 羊抗人IgG溶液混合，室温下磁力搅拌反应1 h。12000 r/min离心30 min，收集沉淀，溶解于10 mL 10 mmol/L硼酸盐缓冲液中。随后向体系中加入60 μL 1 mg/mL HSA溶液，室温磁力搅拌40 min，使AuNPs表面的未结合位点得到封闭。将此反应液12000 r/min离心30 min，倾出上层清液。收集红色沉淀，溶解于5 mL 10 mmol/L硼酸盐缓冲液中，得Ab-AuNPs溶液，于4℃放置备用。

2.2.5 测定条件的优化

在1.5 mL 离心管中加入10 μL IgG-QDs溶液和不同量（0， 50， 100， 150， 200和250 μL）的Ab-AuNPs溶液，用含0.05% 吐温-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）调节体积至500 μL。将离心管放入37℃的摇床中，振荡反应1 h后，进行荧光光谱测定（PMT电压950 V，激发波长300 nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0 nm）。

2.2.6 人IgG的测定

在1.5 mL 离心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液和不同体积（0， 20， 50， 100， 150 ， 200， 250和300 μL）的25 μg/mL人IgG溶液。用含 0.05% 吐温-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）调节体积至490 μL。将离心管放入37℃的摇床中，振荡反应1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的摇床中继续振荡反应1 h。反应结束后，进行荧光光谱测定（PMT电压950 V，激发波长300 nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0 nm）。

2.2.7 共存干扰实验

在1.5 mL 离心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液、100 μL 25 μg/mL人IgG溶液和适量的共存干扰物溶液。用含0.05% 吐温-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）调节体积至490 μL。将离心管放入37℃摇床中振荡反应1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的摇床中继续振荡反应1 h。反应结束后，进行荧光光谱测定（PMT电压950 V，激发波长300 nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0 nm）。

2.2.8 实际样品的测定

6份人血清样品取自当地医院。将血清样品用含0.05% 吐温-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）稀释400倍。在1.5 mL 离心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液，250 μL 待测样品和适量（0， 20和40 μL） 25 μg/mL人IgG溶液。用含0.05%吐温-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）调节体积至490 μL。将离心管放入37℃的摇床中，振荡反应1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的摇床中继续振荡反应1 h。反应结束后，进行荧光光谱测定（PMT电压950 V，激发波长300 nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0 nm）。3 结果与讨论

3.1 Mn掺杂ZnS量子点和AuNPs的表征

SEM结果表明Mn掺杂ZnS量子点颗粒接近球形，粒径约3.5 nm（图1A）。XRD谱图中衍射峰有明显的宽化现象，表明所合成的Mn掺杂ZnS量子点粒子粒径较小。3个衍射峰分别对应于立方型闪锌矿结构的（111）、（220）和（311）3个晶面的衍射，说明所制备的Mn掺杂ZnS量子点为立方形结构。

图1 Mn掺杂ZnS量子点的（A）SEM和（B）XRD图

Fig.1 （A） SEM image and （B） XRD pattem of Mn doped ZnS quantum dots （QDs）

Mn掺杂ZnS量子点的室温磷光发射（RTP）在与IgG偶联后，峰形几乎不变，光强略微降低（图2A）。AuNPs的紫外光谱吸收峰在与羊抗人IgG偶联后有所红移，强度略微降低（图2B）。IgG-QDs的RTP发射光谱和Ab-AuNPs的紫外吸收光谱有部分重叠，有可能发生荧光共振能量转移（FRET）作用（图2C）。

图2 （A）Mn掺杂ZnS量子点（…）和IgG-QDs（—）的RTP发射光谱；（B）AuNPs（…）和Ab-AuNPs（—）的紫外吸收光谱；（C）IgG-QDs的室温磷光（RTP）发射光谱和Ab-AuNPs的紫外吸收光谱

Fig.2 （A） Room temperature phosphorescence （RTP） emission spectra of Mn-doped ZnS QDs and IgG-QDs； （B） Absorption spectra of AuNPs and Ab-AuNPs； （C） RTP emission spectrum of IgG-QDs and absorption spectrum of Ab-AuNPs

3.2 Ab-AuNPs和IgG-QDs比例优化

考察了Ab-AuNPs和IgG-QDs比例对IgG-QDs磷光淬灭的影响（图3），当IgG-QDs和Ab-AuNPs的比例为1∶15时，淬灭效果最好。为保持抗体活性，体系pH=7.4，温度为37℃。

图3 Ab-AuNPs和IgG-QDs比例对IgG-QDs磷光强度的影响

Fig.3 Effect of the ratio of Ab-AuNPs to IgG-QDs on RTP intensity of IgG-QDs

3.3 传感机理

体系RTP的强度与待测样品中人IgG浓度之间的定量关系可由Forster偶极-偶极相互作用模型解释（图4）。当IgG-QDs表面的人IgG与Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG特异性结合后，IgG-QDs与Ab-AuNPs之间的距离被拉近，从而发生FRET效应，引起IgG-QDs RTP淬灭。而当IgG-QDs表面的人IgG不与Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG特异性结合时，IgG-QDs与Ab-AuNPs之间的距离较远，从而不发生FRET作用，不会引起IgG-QDs RTP淬灭。

当待测样品与Ab-AuNPs溶液混合时，一些Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG会与样品中的人IgG结合。体系中加入IgG-QDs后，已经结合了人IgG的Ab-AuNPs无法再结合IgG-QDs。待测样品中人IgG的量决定了被占据的Ab-AuNPs的量，进而决定了能与Ab-AuNPs结合的IgG-QDs的量， 由此可确定未与Ab-AuNPs结合的IgG-QDs的量。体系RTP强度与待测样品中人IgG浓度之间存在定量关系。因此，通过监测体系的RTP强度，就可得出人体血清中的人IgG浓度。

3.4 分析特征量

IgG-QDs用于检测IgG的线性范围为1.0～10 μg/mL，线性相关系数R2=0.9943，检出限为0.45 μg/mL（见图5）。人IgG浓度为5.0 μg/mL时，11次重复测定的精密度为1.5%。

图5 IgG-QDs的磷光强度随IgG浓度的变化（A）和线性关系图（B）

Fig.5 （A） RTP spectra of AuNPs-quenched IgG-QDs in the presence of various concentrations of IgG； （B） corresponding calibration curve

3.5 共存干扰

考察了金属离子、阴离子、葡萄糖、氨基酸和蛋白质等对体系RTP强度的影响（表1）。结果表明，由于人IgG与羊抗人IgG之间的特异性结合，本方法表现出对人IgG高的选择性。

3.6 血清样品中人IgG的测定

将本方法用于检测实际人血清样品中人IgG，加标回收率在98%～113%之间（表2）。此外，由于采用磷光模式检测可以消除血清样品背景干扰，而荧光模式下血清样品背景干扰比较明显（图6）。

2.1[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][]

4 结 论

制备了IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金纳米粒子，利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金纳米粒子之间的荧光共振能量转移效应，构建了人体血清中人IgG的室温磷光检测新方法。本方法可有效避免基体自发荧光和基质散射光等背景信号的干扰，可用于高选择性检测生物体液中的人IgG。

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