猫爪草综合提取工艺研究

夏新奎　郭亚琼等

摘要：为了考察影响猫爪草综合提取工艺的各因素，确定猫爪草综合提取最佳工艺条件，在前期单因素考察的基础上，以浸提温度、超声频率、超声时间和固液比为考察因素，以猫爪草干膏率和多糖提取率为考察指标，采用正交试验设计考察猫爪草最佳提取工艺。结果表明，猫爪草最佳提取工艺为浸提温度50 ℃，超声频率40 kHz，每次超声20 min，固液比1∶30。在此条件下，猫爪草干膏率为38.90%，多糖提取率为32.71%。

关键词：猫爪草；综合提取；超声技术；正交试验

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3720-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.036

Abstract： To establish the optimal integrated extraction process of Radix Ranunculi Ternati， orthogonal design experiment， based on single factor test，was carried out， taking the dry extract yield and the polysaccharide extraction rate as comprehensive evaluation indicator， and the temperature of extraction solvent， ultrasonic frequency，ultrasonic time and the proportion of herbs and extraction solvent as investigation factors. The results showed that the optimum extraction process conditions were as follows：the temperature of extraction solvent and ultrasonic medium was 50 ℃； the ultrasonic frequency was 40 kHz； the ultrasonic time was 20 min each time； and the proportion of herbs and extraction solvent was 1∶30. Under this condition， the dry extract yield of Radix Ranunculi Ternati was 38.90% and the polysaccharide extraction rate was 32.71%.

Key words： Radix Ranunculi Ternati； integrated extraction； ultrasonic extraction technology； orthogonal test

猫爪草系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥块根。河南省信阳地区既是猫爪草的发现地和野生分布区，又是目前国内猫爪草的主要栽培区，猫爪草已是信阳市乃至河南省又一味道地药材。猫爪草性温，味甘、辛，归肝、肺经，具有化痰散结、解毒消肿的功效，用于治疗瘰疬痰核，疔疮肿毒，蛇虫咬伤[1]。猫爪草的化学成分主要有糖类、黄酮类与苷类、氨基酸、生物碱苷类、有机酸、甾醇及酯、挥发油和微量元素，猫爪草的药理作用主要有抗结核、抗菌、抗癌、免疫调节作用、保护性抑制作用、抗氧化作用等[2]。猫爪草已成为国家重点发展的三类药材之一[3]。现代药理研究[4，5]证明，猫爪草多糖（RTP）及其皂苷（RRTS）均具有兴奋免疫活性作用，也是其重要的抗肿瘤活性成分，RTP具有明显的免疫调节作用和抗氧化作用[5]，猫爪草皂苷对多种癌症[4，6-8]均有抑制作用。猫爪草的水煎液[9]、有机酸部位[10]、醇提物[11]、小毛茛内酯[12]等均具有抗结核作用。目前猫爪草提取方面的研究多停留在对猫爪草多糖[13，14]、小毛茛内酯[15]等有效部位的提取工艺研究，舍弃了其他有价值的成分，不利于猫爪草的综合利用；且在上述提取过程中使用了石油醚、乙醚[13，14]等有机溶剂，不适合综合生产。目前尚未见对其有效成分综合提取的研究报道，因此很有必要对猫爪草进行综合提取，最大限度地保留其有效成分，发挥其综合疗效；或者将其不同有效成分单独分离纯化，满足临床的不同需求。本研究以浸提温度、超声频率、超声时间、固液比为考察因素，由于多糖含量较高且作用显著，故以猫爪草干膏率和多糖提取率为指标，以期为充分利用猫爪草的产地资源，对猫爪草进行综合提取研究，将猫爪草就地转化成附加值较高的猫爪草总皂苷、有机酸、多糖或总提取物提供依据，一方面可满足临床治疗的不同需求，另一方面也可减少营运成本，增加猫爪草收益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 猫爪草药材购自河南淮滨县王岗乡毛庄村，由杨俊杰老师（信阳农林学院，中药专业，副教授）鉴定。无水葡萄糖标准品（中国计量科学研究院，批号为GBW1006213001，含量为99.6%）、蒽酮、硫酸、乙醇等均为分析纯，纯化水自制。

1.1.2 仪器 751G型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；DL-5型离心机（上海安亭科学仪器厂）；电磁炉（美的集团）；SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；水循环恒温水浴箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；AB-135-S型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；PB602-S电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；101AS-2电热恒温干燥箱（上海实验仪器有限公司）；SCQ-8201E超声清洗仪（上海声彦超声波仪器设备有限公司）。

1.2 药材处理

将猫爪草挑拣、淘洗后，105 ℃烘干，粉碎成60目，备用。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制备 ①葡萄糖标准溶液的配制。精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品25.4 mg于250 mL容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得葡萄糖浓度为101.6 μg/mL的对照品溶液。②标准曲线的制备。精密量取上述葡萄糖标准溶液0.4，0.8，1.0，1.2，1.5，2.0 mL于6只干燥的10 mL容量瓶中，加纯化水至2 mL，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1 g，加100 mL硫酸溶解，摇匀，即得），室温放置15 min后，立即置于冰浴中冷却15 min，取出，以不加葡萄糖的溶液作为空白对照，采用紫外-可见分光光度法[1]，在625 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标得标准曲线A=0.010 454C+0.006 820（r=0.999 3），结果表明葡萄糖在5.08～25.40 μg/mL范围内线性关系良好。

1.3.2 猫爪草干膏率和多糖含量的测定 ①猫爪草干膏率的测定。精密称取猫爪草浸膏，置于干燥的蒸发皿中，按《中华人民共和国药典》[1]水分测定法（附录IX H）第一法（烘干法）测定，计算干膏率。②猫爪草多糖含量的测定。采用蒽酮-硫酸法测定，参照《中华人民共和国药典（第二增补本）》[16]灵芝多糖含量测定项下方法测定猫爪草多糖。准确称取猫爪草干浸膏（湿膏折算成干膏）0.15 g，置25 mL容量瓶中，加纯化水超声溶解并稀释至刻度。过滤，精密移取滤液10 mL置于小烧杯中水浴蒸干，加1 mL纯化水超声使其溶解，加无水乙醇10 mL，放置30 min，2 000 r/min离心5 min，沉淀物用热纯化水溶解并转移至25 mL容量瓶中，放冷，加纯化水至刻度，摇匀。取溶液适量，离心，精密量取上清液1 mL置于50 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。按照“1.3.2”中“②”的方法测定吸光度，计算，即得。

1.3.3 猫爪草综合提取工艺的正交试验 准确称取猫爪草60目药粉100 g，将浸提溶剂加热至规定温度，首次浸泡时间为30 min。依据猫爪草综合提取单因素试验结果，将以下因素列为固定条件：超声介质温度为60 ℃，超声功率300 W，总提取次数3次，第一次提取溶剂为95%乙醇，第二次提取溶剂为70%乙醇，第三次提取溶剂为饮用水。提取效率以猫爪草干膏率、多糖提取率进行综合评分，提取效率满分为1.0，猫爪草干膏率、多糖提取率满分分别为0.5。把对提取效率影响较大的因素浸提温度（A）、超声频率（B）、超声时间（C）、固液比（D）作为考察因素，采用正交表L9（34）进行试验，确定猫爪草综合提取最佳工艺条件，因素与水平见表1。其中固液比是指猫爪草质量（g）与提取溶剂总用量（mL）的比值，且3种提取溶剂用量相同；超声时间指3种提取溶剂提取的总时间，各溶剂提取时间相同。

2 结果与分析

正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。由表2和表3可知，猫爪草综合提取中各因素对猫爪草干膏率、多糖提取率影响的主次顺序为A、B、C、D，即浸提温度为主要影响因素，其次是超声频率，固液比影响最小。确定的最佳提取工艺为A1B2C1D2，即浸提温度为50 ℃，超声频率为40 kHz，超声时间为60 min，固液比为1∶30。验证试验结果表明，在该条件下，猫爪草干膏率分别为38.60%、39.28%、38.83%，平均干膏率38.90%；猫爪草多糖提取率分别为33.01%、32.49%、32.62%，平均多糖提取率为32.71%，高于正交表中任何一组的试验结果。是惟一国家药品标准品种猫爪草胶囊干膏率的4.4倍，提取时间也减少了1.5 h。

3 讨论

目前有关猫爪草提取方面的研究还不够深入，比如猫爪草有机酸的提取[10]、猫爪草总皂苷的提取[8]均没有进行工艺优化；另外有关猫爪草有效成分含量的测定报道较少，测定方法也不固定，比如猫爪草多糖的测定有采用苯酚-硫酸法的[13，14]，也有采用蒽酮-硫酸法的[17]，应考察两种方法对猫爪草多糖测定结果的影响；目前猫爪草总皂苷尚无含量测定方面的报道。

本试验采用蒽酮-硫酸法测定猫爪草多糖，在操作中发现有很多因素对猫爪草多糖测定结果有影响，比如显色的时间、温度、操作的快慢等对测定结果均有不同程度的影响，且操作费时、繁琐，应在以后的研究中探索出更为便捷、灵敏的猫爪草多糖测定方法。

在本试验的基础上，还可以对两次醇提、一次水提的结果分别进行考察，把皂苷、有机酸、内酯提取率也纳入考察范围，比如醇提取的影响因素试验和水提取的影响因素试验可分别进行，这有待进一步探讨。

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