ELOVL2基因多态性与乳母乳汁DHA水平的关联性分析

李　响，丁　珍，吴义霞，陈雪妍，刘国良，谢　林

(1.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学公共卫生学院预防医学实验中心，吉林 长春 130021)

ELOVL2基因多态性与乳母乳汁DHA水平的关联性分析

李响1，丁珍1，吴义霞1，陈雪妍1，刘国良2，谢林1

(1.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学公共卫生学院预防医学实验中心，吉林 长春 130021)

目的:探讨ELOVL脂肪酸延长酶基因2(ELOVL2) rs2281591和rs3798713位点与乳母乳汁二十二碳六烯酸(DHA)水平的关系，阐明ELOVL2基因多态性对乳汁DHA水平的影响。方法:选取健康产妇209人，在产后第22～25天签署知情同意书并进行三天二十四小时膳食回顾调查，收取乳汁20 mL，应用气相色谱法检测乳汁DHA水平，并提取乳汁基因组DNA，应用Sequenom Mass Array 系统检测ELOVL2基因2个单核苷酸多态性(SNP)位点基因型，采用UNPHASED 3.012遗传学软件进行多位点单倍型与乳汁DHA水平的数量性状分析。结果:ELOVL2基因rs2281591和rs3798713位点基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)；不同基因型的乳母膳食脂肪酸摄入量和乳汁DHA水平差异均无统计学意义(P>0.05)；不同rs3798713(CG) -rs2281591(AG)单倍型的乳母乳汁DHA水平比较差异无统计学意义(χ2=3.422，df=5,P=0.635)。结论:ELOVL2基因rs3798713和rs2281591位点及其组成的单倍型与乳母乳汁DHA水平无关联。

基因多态性；单倍型；ELOVL2基因；乳汁；二十二碳六烯酸

哺乳期妇女膳食脂肪酸的摄入量除影响自身脂肪酸营养状况外，还可能通过胎盘、乳汁而影响胎儿及婴儿脂肪酸水平，并因此对婴儿智力发育产生影响[1-3]。二十二碳六烯酸 (docosahexenoic acid,DHA) 是一种重要的n-3系长链多不饱和脂肪酸，为人类早期发育所必需。乳汁中充足的DHA水平对婴儿生长发育、尤其是脑发育起重要作用。DHA 的生物合成过程是在一系列前体脂肪酸的基础上，通过不断进行脂肪酸碳链延长和脂肪酸脱氢反应而获得。最新研究[4]表明:ELOVL脂肪酸延长酶基因2 (ELOVL fatty acid elongase 2,ELOVL 2) 可以编码长链脂肪酸延长酶，是多不饱和脂肪酸代谢通路上重要的限速酶，其活性直接影响多不饱和脂肪酸的合成。国外研究[5-7]表明:ELOVL基因的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP) 与人体不同组织中的脂肪酸组成谱相关联，不同基因型携带者的人体脂肪酸组成存在显著性差异，但国内的相关研究较少。本研究旨在探讨中国汉族乳母ELOVL2基因多态性与乳汁DHA水平的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象选择吉林省长春市健康乳母209人,均签署知情同意书。本研究得到吉林大学公共卫生学院医学伦理委员会批准。排除标准：非汉族，孕期或哺乳期服用过含有多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid,PUFA) 补充剂的乳母，并发有高血压、糖尿病及其他疾病处于治疗期的乳母。

1.2调查方法由经过统一培训的调查人员于产后第20～22天采用“面对面”方式进行询问，记录乳母的基本情况 (包括年龄、身高、体质量、文化程度、分娩方式和经济状况等)。采用三天二十四小时膳食回顾法收集乳母膳食资料，并用《金钥匙营养专家系统-孕产妇版》(上海营康)和《中国食物成分表》[8]估算乳母膳食脂肪酸摄入量。

1.3乳汁样本的采集和测定于产后第22～25天上午9：00～11:00手动采集乳母乳汁20 mL于冷冻管中，置于-80℃冰箱待测。提取乳汁脂肪层，采用直接酯化一步法生成脂肪酸甲酯，取1 μL甲酯进样于岛津(GC-14C)型气相色谱仪(Shimadzu公司，日本)进行脂肪酸甲酯浓度检测，通过DHA脂肪酸甲酯转换系数计算出DHA水平[9]。

1.4SNPs位点选择和基因型检测①利用国际单倍型图工程数据库(Hapmap)和美国国立图书馆数据库(NCBI)等公共数据库，并应用Haploview 4.2软件筛选基因的2个标签SNPs位点，其次等位基因频数在中国汉族人群中大于10%；②采用基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)提取乳母乳汁基因组DNA，并用Eppendorf蛋白核酸测定仪测定DNA的浓度及纯度。应用Sequenom Mass Array 系统检测ELOVL2基因型(北京博淼生物科技有限公司检测)。

2　结　果

2.1健康乳母的基本情况汉族乳母209人，平均年龄(30.00 ± 4.00)岁，平均身高(1.64±0.07)m，孕期平均增加体质量(18.87±6.87)kg; 顺产乳母66人(31.58%)，剖腹产143人(68.42%)；文化程度为高等教育(大学、研究生及以上)的乳母130人(62.20%),教育水平为中等及以下的乳母占79人(37.80%)；月家庭收入在10 000元以上的乳母46人(22.01%)，5 000～10 000元119人(56.94%)，2 000～5 000元79人(21.05%)。

2.2不同SNPs位点等位基因和基因型频数分布ELOVL2基因2个位点的等位基因和基因型频数见表1。rs3798713和rs2281591位点检出率分别为97.13%和99.52%。各位点基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明所选样本具有群体代表性。209名乳母rs3798713和rs2287591位点的主等位基因(Major)频数分别为66.0%和80.3%；m(minor)代表次等位基因，两位点频数分别为34.0%和19.7%，符合NCBI数据库中亚洲人群该SNPs位点主次等位基因分布频数。

表1　ELOVL2基因SNP位点等位基因及基因型频数

aM:Major allele;m:Minor allele;P:Pvalue of Hardy-Weinberg equilibrium.

2.3不同SNPs位点膳食脂肪酸摄入量和乳汁DHA水平比较根据不同SNPs位点基因型将乳母进行分组，检测不同基因型组间乳母的膳食脂肪酸摄入量以及乳汁DHA水平，不同基因型组间乳母的膳食脂肪酸摄入量及乳汁DHA水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2和3。

表2rs3798713位点不同基因型乳母膳食脂肪酸摄入量及乳汁DHA水平比较

表3rs2281591位点不同基因型乳母膳食脂肪酸摄入量及乳汁DHA水平比较

2.4单倍型与乳汁DHA水平的数量性状分析不同rs3798713(CG)-rs2281591(AG)单倍型系统与乳母乳汁DHA水平的数量性状分析结果见表4。不同单倍型系统的乳母乳汁DHA水平比较差异无统计学意义(χ2=3.422，df=5，P=0.635)。

表4rs3798713(CG)-rs2281591(AG)单倍型与乳母乳汁DHA水平的数量性状分析

Tab.4Quantitative trait analysis of rs3798713(CG)-rs2281591(AG) haplotypes and DHA levels in breast milk of maternals

HaplotypenMarFreqAddVal95%Lo95%Hiχ2PC-C-A-A410.20300000.0460.831C-C-A-G660.32674.197-7.7016.091.1420.285C-C-G-G230.1139-3.063-21.3315.200.3150.575C-G-A-A360.1782-5.501-22.6611.651.1930.275C-G-A-G260.1287-0.597-17.1915.990.0630.802G-G-A-A100.04959.176-8.0326.381.4900.222

Global Likelihood ratio chisq= 3.422 ，df=5，P=0.635.Haplotype SNP order is rs3798713 (CG) -rs2281591 (AG)With haplotype C-C-A-A,major alleles for all SNP,as the reference.MarFeq:Marker frequency is the frequency of the haplotype distribution.AddVal:Additive value indicates the additive effect of the haplotype shown on the breast milk DHA level.

3　讨　论

大量文献[10-13]报道了膳食对乳汁脂肪酸水平的影响，而最新国外研究文献表明了基因遗传变异对人体脂肪酸水平的影响。本组研究对象为中国北方汉族乳母，不同基因型的研究人群膳食脂肪酸摄入量差异无统计学意义，表明样本人群的膳食脂肪酸摄入无组间差异。ELOVL2基因位于染色体6p24.2区域，由7个内含子和8个外显子构成，长度约为36 000 bp，编码296种氨基酸。ELOVL2 基因是编码PUFAs 合成过程中的重要限速酶，影响PUFAs 的合成代谢。最新研究[14-16]表明：ELOVL基因簇参与脂肪酸碳链延长过程，形成更多复杂的长链多不饱和脂肪酸(如DHA)。Lemaitre等[7]观察了5个欧洲队列人群共8 866个人体的全基因组关联结果发现:ELOVL2延长酶基因多态性与血浆磷脂4种主要n-3多不饱和脂肪酸水平相关联，rs2236212次等位基因携带者DHA水平显著降低(P=1×10-15)。本研究检测的rs3798713位点与rs2236212位点在中国汉族人群中高度连锁(D′=1.00，r2=1.00)，2位点处于同一个连锁不平衡区域内，但本研究尚未发现其可影响乳汁DHA水平。Tanaka等[5]对InCHIANTI研究中1 075位个体进行全基因组关联研究发现:ELOVL2基因上的rs953413位点的次等位基因携带者血浆中EPA和DPA水平较高，而DHA水平较低。ELOVL2基因共有3个BLOCK，研究报道的阳性位点均来自BLOCK1。基于上述研究结果，本研究选择同样位于BLOCK1中的2个标签SNPs位点(rs3798713和rs2281591)进行研究，ELOVL2基因2个SNPs位点基因频数与Hapmap数据库亚洲人群基因频数相似，但尚未发现这2个位点与中国汉族乳母乳汁DHA水平的关联，分析其原因如下：①可能是样本来源不一致。中国人群样本rs3798713位点次等位基因频数(34%)与研究报道中欧洲人的频数(57%)相差很大，存在种族差异；②欧洲队列研究检测样本是血浆DHA(DHA占总脂肪酸的百分比)，而本研究检测的样本是乳汁DHA(DHA的实际浓度),检测样本的差异也可能导致检验效率的不同；③可能受样本量的影响，本研究中只有样本209例。目前不同rs3798713(CG)-rs2281591(AG)单倍型系统与乳母乳汁DHA水平关联研究尚未见报道，因此对于ELOVL2基因多态性与DHA水平的关系研究有待扩大样本量，且在另外2个BLOCK里选择更多的标签SNPs继续研究或在其他群体中进一步验证。

[1]Innis SM.Essential fatty acid transfer and fetal development [J].Placenta,2005,26(1):S70-75.

[2]Innis SM,Friesen RW.Essential n-3 fatty acids in pregnant women and early visual acuity maturation in term infants[J].Am J Clin Nutr,2008,87(3):548-557.

[3]钱兴国,苏宜香,苗丽曼,等.孕妇乳母二十二碳六烯酸摄入水平对婴儿早期运动发育和视力功能的影响[J].中国儿童保健杂志，2004，12(4):321-324.

[4]Innis SM.Perinatal biochemistry and physiology of long-chain polyunsaturated fatty acids [J].J Pediatr,2003,143(4):S1-8.

[5]Tanaka T,Shen J,Abecasis GR,et al.Genome-wide association study of plasma polyunsaturated fatty acids in the InCHIANTI Study[J].PLoS Genet,2009,5(1):e1000338.

[6]Illig T,Gieger C,Zhai GJ,et al．A genome-wide perspective of genetic variation in human metabolism[ J]．Nature Genetics,2010，42(2)：137-141．

[7]Lemaitre RN,Tanaka T,Tang W,et al.Genetic loci associated with plasma phospholipid n-3 fatty acids:a Meta-analysis of genome-wide association studies from the CHARGE consortium[J].PLoS Genet,2011，7(7):e1002193.

[8]杨月欣.中国食物成分表[M].2版.北京：北京大学医学出版社，2009.

[9]中华人民共和国卫生部GB28404-2012保健品中α-亚麻酸，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定[S].北京：中华人民共和国国家标准，2012.

[10]余曼,陈波,张瑞,等.DHA与EPA合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较[J].实用医院临床杂志，2014,9(5):24-27.

[11]Dixon AL,Liang L,Moffatt MF,et al.A genome-wide association study of global gene expression[J].Nat Gene,2007,39(10):1202-1207.

[12]Moffatt MF,Kabesch M,Liang L,et al.Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhoodasthma[J].Nature,2007,448(7152):470-473.

[13]Morales E,Bustamante M,Gonzalez JR.et al.Genetic Variants of the FADS Gene Cluster and ELOVL Gene Family,Colostrums LC-PUFA Levels,Breastfeeding,and Child Cognition[J].PLoS One,2011,6(2):e17181.

[14]Hoile SP,Clarke-Harris1 R,Huang RC,et al.Supplementation with N-3 long-chain polyunsaturated fatty acids or olive oil in men and women with renal disease induces differential changes in the DNA methylation of FADS2 and ELOVL5 in peripheral blood mononuclear cells[J].PLoS One,2014,9(10):e109896.

[15]Cormier H,Rudkowska I,Lemieux S.et al.Effects of FADS and ELOVL polymorphisms on indexes of desaturase and elongase activities:results from a pre-post fish oil supplementation[J].Genes Nutr,2014,9(6):437.

[16]沈文娟，哈明昊.白细胞介素28B基因多态性与慢性HBV、HCV感染的相关性[J].临床肝胆病杂志，2014，30(10)：1087-1090.

Association analysis on polymorphisms of ELOVL2 gene and DHA level in breast milk of lactating mothers

LI Xiang1,DING Zhen1,WU Yixia1,CHEN Xueyan1,LIU Guoliang2,XIE Lin1

(1.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Experimental Center of Preventive Medicine,School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the association between rs2281951 and rs3798753 in ELOVL fatty acid elongase2 (ELOVL2 gene) and the docosahexenoic acid(DHA)level in breast milk,and to clarify the influence of the polymorphisms of ELOVL2 gene in the DHA level of breast milk.Methods 209 healthy maternals were selected and signed the consent form and completed the 3-day 24-hour dietary recall questionaire on one day during the 22nd-the 25th day after partum, and 20 mL breast milk was collected.The DHA level in breast milk was detected with gas chromatography.The milk DNA was extracted and two single nucleotide polymorphisms(SNPs)of ELOVL2 gene were detected by Sequenom Mass Array System.UNPHASED 3.012 genetics software was adopted to analyze the quantitative trait of haplotype and the DHA level in breast milk.ResultsThe distribution of genotypic frequencies of rs2281591 and rs3798713 sites in ELOVL2 gene was consistent with Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05).The dietary fatty acid intakes and the milk DHA levels of maternals carrying different genotypes had no statistically significant differences (P>0.05).The DHA levels in breast milk of maternals carring different rs3798713 (CG)-rs2281591 (AG) haplotypes had no statistically significant difference (χ2= 3.422,df=5,P=0.635).Conclusion Rs3798713 and rs2281951 and constructed haplotypes in ELOVL2 gene are not related to the DHA levels in breast milk.

gene polymorphism; haplotype; ELOVL2 gene; breast milk; docosahexenoic acid

1671-587Ⅹ(2015)06-1230-05

10.13481/j.1671-587x.20150625

2015-02-02

国家自然科学基金资助课题(81102115)

李响(1990-)，女，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事营养与健康关系方面的研究。

谢林，教授，博士研究生导师(Tel:0431-85619455,E-mail：xielin@jlu.edu.cn)

R153.1

A

网络出版时间:2015-08-12 09:06:40

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20150812.0906.002.html