丹参磷脂浸膏对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

曲　圆，付丹阳，纪影实

(1.吉林大学第二医院骨科， 吉林 长春 130041；2.吉林大学基础医学院药理学系,吉林 长春 130021)

丹参磷脂浸膏对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

曲圆1，付丹阳*，纪影实2

(1.吉林大学第二医院骨科， 吉林 长春 130041；2.吉林大学基础医学院药理学系,吉林 长春 130021)

目的：观察丹参磷脂浸膏(DSLZ)对脑缺血再灌注损伤的保护作用，探讨其可能机制。方法：60只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照丹参酮ⅡA组和低、中、高剂量DSLZ组(5.0、10.0、20.0 mg·kg-1，以丹参酮ⅡA计)，每组10只。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2 h、再灌注22 h后检测大鼠神经功能评分，TTC染色检测大鼠脑梗死面积百分比，HE染色检测大鼠脑组织病理形态学，检测大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分升高(P<0.05)，脑梗死面积百分比增大(P<0.05)，脑组织中SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA和NO水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，中、高剂量DSLZ组大 鼠神经功能评分降低，脑梗死面积百分比明显缩小，脑组织中 SOD活性明显升高， MDA及NO水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色，模型组大鼠神经细胞胞膜不清，细胞出现肿胀、变形、坏死，细胞间质水肿，细胞间隙增大；高剂量DSLZ组大鼠神经细胞核仁清晰，间质轻微水肿。结论：DSLZ可减轻脑缺血大鼠神经细胞损伤，其机制可能与减轻自由基损伤、抑制NO神经毒性有关联。

丹参磷脂；脑缺血灌注；氧化应激；超氧化物歧化酶；丙二醛

丹参是唇型科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、调经止痛和养血安神等功效。丹参具有改善微循环、清除自由基和抗脂质过氧化等作用，并广泛应用于冠心病、缺血性脑卒中等缺血性疾病的临床治疗。丹参既可单独使用亦可与其他多种药物配伍用于缺血性心脑血管病的治疗。丹参酮(tanshinone，Tan)是丹参中脂溶性二萜类化合物，按其结构可分为丹参酮ⅡA(TanⅡA)、丹参酮ⅡB和隐丹参酮等，其中丹参酮ⅡA是丹参中主要成分[1]。磷脂酰胆碱是乙酰胆碱的前体，其在体内水解成胆碱等物质，参与大脑的记忆和思维活动[2]。而丹参磷脂浸膏(danshenlinzhi,DSLZ)对于脑缺血的影响国内外尚无相关报道。本研究观察DSLZ(丹参酮ⅡA∶磷脂酰胆碱比例为2∶1)对于脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

1　材料与方法

1.1动物、主要试剂和仪器雄性Wistar大鼠120只，体质量180～220 g，购自吉林大学动物中心，清洁级，动物许可证编号:SYXK(吉)2007-0011。DSLZ由吉林大学化学学院提供，丹参酮ⅡA(Sigma公司，美国，批号：A02121005)，超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛(NO)和一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物公司，中国)。LR56495型台式低温高速离心机(Thermoerectron公司，美国)，RS232酶标仪(Sunrise公司，美国)，CX21FS1C光学显微镜(奥林巴斯有限公司，日本)。

1.2动物分组和给药雄性Wistar大鼠平均分为2批，第1批用于观察大鼠神经功能评分和脑梗死面积，第2批用于检测大鼠脑组织 中SOD 活性、MDA和 NO水平及病理组织形态学，每批大鼠60只，每批大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、阳性对照丹参酮ⅡA(20.0 mg·kg-1)组和低、中、高剂量DSLZ组(5.0、10.0、20.0 mg·kg-1，以丹参酮ⅡA计)，每组10只。DSLZ用大豆油配制备用。在大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备前，连续灌胃给药10 d。假手术组和模型组大鼠给予同体积的大豆油。

1.3大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制备于末次给药后30 min，大鼠经腹腔注射20%乌拉坦(1 g·kg-1)麻醉。行颈正中切口，分离右侧颈总动脉(arteria carotis communis,CCA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)及颈外动脉(external carotid artery,ECA)，用动脉夹夹闭CCA，并在CCA剪开一小口，将直径0.175 mm的尼龙线插入约18 mm，阻塞大脑中动脉起始部，然后逐层缝合肌肉和皮肤，单笼饲养。术后自由进食水，2 h后拔出栓线使血流再灌注22 h，假手术组大鼠仅分离右侧 CCA、ICA和ECA，其余同上。

1.4大鼠神经功能评分大鼠再灌注 22 h后进行行为指标评分：活动正常大鼠为 0分；竖毛、轻度运动低下大鼠为 0.5分；前肢屈曲运动障碍大鼠为 1.0分；行动不协调、旋转运动大鼠为2.0分；偏瘫、不能站立和行走大鼠为 3.0分；痉挛、昏睡大鼠为 4.0分；死亡大鼠为 5.0分(术后2 h以上死亡)。

1.5大鼠脑梗死面积百分比测定大鼠断头取脑，将脑组织行冠状切片，间隔4 mm，共5片，放入2% TTC磷酸盐缓冲液(pH 7.4)37℃水浴中10 min，正常大鼠脑组织呈深红色，梗死的脑组织呈白色。将每片组织照相，应用BI2000软件处理系统计算各部分面积，脑梗死面积百分比=非染色区面积之和/脑组织面积之和×100%。

1.6大鼠脑组织中SOD活性和MDA、NO水平测定实验结束后，处死大鼠，冰上断头取脑，制备10%脑组织匀浆，采用SOD、MDA和NO检测试剂盒进行检测。

1.7大鼠脑组织病理学检测取大鼠脑组织，用10%甲醛固定，0.01 mol·L-1PBS浸泡过夜，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，经二甲苯脱蜡及梯度乙醇复水后，行HE染色，再进行梯度乙醇脱水，滴加中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

2　结　果

2.1大鼠神经功能评分和脑梗死面积百分比与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分升高(P<0.05)，TTC染色可见明显的梗死灶，说明模型成立。与模型组比较，中、高剂量DSLZ组及阳性对照丹参酮ⅡA组大鼠脑梗死面积百分比明显缩小(P<0.05或P<0.01)，神经功能评分均明显降低(P<0.05)。见表1和图1(插页三)。

2.2大鼠脑组织中SOD活性和MDA、NO水平与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中MDA、NO水平明显增高，SOD活性明显减低(P<0.01)；与模型组比较，低、中、高剂量DSLZ组大鼠脑组织中MDA和NO水平呈剂量依赖性降低，其中，中、高剂量DSLZ组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中、高剂量DSLZ组大鼠脑组织中SOD活性明显升高(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表1各组大鼠神经功能评分和脑梗死面积百分比

GroupNeurologicscorePercentageofinfarctionarea(η/%)Sham0 0Model3.30±0.67*43.90±2.70*TanⅡA2.28±0.28△31.70±2.50△DSLZ(mg·kg-1) 5.02.75±0.3239.30±5.10 10.02.55±0.49△32.70±3.15△ 20.02.15±0.43△26.60±2.70△△

*P<0.05 compared with sham group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

表2　各组大鼠脑组织中SOD活性和MDA、NO 水平

*P<0.01 compared with sham group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.3各组大鼠脑组织病理形态学假手术组大鼠神经细胞膜清晰完整，无水肿，核仁清晰可见。模型组大鼠神经细胞膜不清，出现肿胀，变形，神经细胞坏死，间质水肿，细胞间隙增大。高剂量DSLZ组大鼠神经细胞核仁清晰，间质轻微水肿，脑组织损伤程度较阳性药丹参酮ⅡA组大鼠减轻。见图2(插页三)。

3　讨　论

脑功能活动的正常有赖于一定量的脑血流供应，当血流供应突然停止或突然减少，会引起脑功能损伤，动物则表现为不同程度的神经功能缺损。缺血一定时间后即使恢复血流供应，损伤仍进一步加重，病理检测显示动脉供血区出现梗死灶，神经细胞变性和坏死[3]。研究[4-5]表明：丹参能够减轻氧化应激损伤，缩小急性心肌梗死范围。亦有研究[6]表明：磷脂酰胆碱具有防治心血管疾病、增强记忆力等多种功能作用。本研究结果显示：DSLZ能够缩小脑梗死面积，减轻神经细胞损伤程度，改善大鼠行为指标,DSLZ治疗脑缺血再灌注损伤效果强于单独应用丹参酮ⅡA。

脑缺血再灌注时自由基(oxygen free radical,OFR)大量产生，此时脑组织清除自由基的能力则下降，体内氧化系统和抗氧化系统平衡失调，造成OFR大量堆积， 导致脑组织氧化损伤。研究[7-9]显示：OFR增加是再灌注损伤的主要机制之一。脑缺血再灌注时OFR生成增多已被大量的研究所证实，大鼠大脑中动脉结扎15 min后羟自由基开始升高，可持续到再灌注30 min。在脑缺血早期， 由一氧化氮合酶(NOS) 催化 L-精氨酸生成的内源性 NO 主要表现为脑保护作用；而在缺血中后期， 因疾病处于持续状 态，NOS 表达增多，产生大量 NO，对细胞产生严重的毒性作用，此结果与国内研究[10-12]相似。OFR可损害神经元等富含脂质的脑细胞，使多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，促使多糖分子聚合和解聚，引起生物膜裂解，蛋白质变性，酶丧失活性，神经元死亡或凋亡。SOD 是一种抗氧化酶，其活性的高低可直接反映组织 清除自由基的能力。MDA作为脂质过氧化产物，其水平可间接反映组织的损伤程度。本研究结果显示：DSLZ可提高大鼠脑组织中SOD活性，降低MDA水平，同时降低脑组织中NO水平，说明DSLZ能够减轻NO神经毒性作用。

综上所述，丹参酮ⅡA与磷脂酰胆碱配伍对脑缺血再灌注损伤具有良好的防治作用，本研究为DSLZ成为临床治疗脑缺血的药物提供了实验依据[13-16]。

[1]张家堂,郎森阳,匡培根,等.丹参对大鼠局灶性脑缺血后神经元内细胞周期蛋白D1表达的影响[J]. 中华老年心脑血管病杂志,2001,3(4):272-275.

[2]罗建,王晔,程薇.磷脂酰胆碱对小鼠记忆障碍模型的影响[J].现代预防医学,2011,38(3):446-448.

[3]Wu LF,Liu YY,Fang SH,et al. Protective effect of recombinant human glutaredoxin-1 against the cerebral ischemia reperfusion injury in mice[J].Chin Pharmacol Bull,2007,23(5):641-643.

[4]Tu Q,Wang R,Qing B.Protective and antioxidant effect of Dan-shen polysaccharides on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].Int J Biol Macromol,2013,60:268- 271.

[5]Tan H,Huang XP,Deng CQ. Effects of astragalosides and Panax notogiseng saponins combination on oxidative stress of cerebral ischemic reperfusion injury in mice[J].J Chin Integr Med,2010,8(5):448-452.

[6]陈正跃,许建文,张光军.水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床康复,2004,8(22):4631-4633.

[7]Pan C,Lou L,Huo Y,et al.Salvianolic acid B and tanshinone ⅡA attenuate myocardial ischemia injury in mice by NO production through multiple pathways [J].Ther Adv Cardiovasc Dis,2011,5(2):99-111.

[8]Wang TF,Lei Z,Li YX,et al.Oxysophoridine protects against focal cerebral ischemic injury by inhibiting oxidative stress and apoptosis in mice [J].Neuroche Res,2013,38(11):2408-2417.

[9]Dang S,Liu X,Fu P,et al.Neuroprotection by local intra-arterial infusion of erythropoietin after focal cerebral ischemia in rats[J].Neurol Res,2011,33(5):520-528.

[10]Xu W,Yang J,Wu LM. Cardioprotective effects of tanshinone IIA on myocardial ischemia injury in rats [J].Pharmazie,2009,64(5):332-337.

[11]董文鹏,章翔,高大宽,等. 白藜芦醇对小鼠局灶性缺血/再灌注后急性期的影响[J].中国药理学通报,2008,24(8):1032-1035.

[12]李红,张爽,纪影实,等.山楂叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中草药,2010,41(5):794-796.

[13]邓永超,刘煜敏.银杏叶提取物后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的研究[J]. 卒中与神经疾病,2014,21(4):219-221.

[14]刘凤琴,牛小媛,牛文华.大鼠脑缺血再灌注后脑组织水通道蛋白的表达及丹参川芎嗪干预作用的研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2012,12 (3):123-126.

[15]Wen QW,Liang L,Hui CS,et al.Tanshinone ⅡA inhibits metastasis after palliative resection of hepatocellular carcinoma and prolongs survival in part via vascular normalization[J].J Hematol Oncol,2012,5:69.doi:10.1186/1756-8722-5-69.

[16]尚涛，杜玉茗，姚庆青，等.吡格列酮联合丹参对糖尿病脂肪肝患者糖、脂代谢及肝损伤的影响[J].吉林中医药，2013，33(4)：374-375.

*吉林大学临床医学院2011级临床医学专业

Protective effect of Danshenlinzhi on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism

QU Yuan1,FU Danyang*,JI Yingshi2

(1.Department of Orthopedics,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 3.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Danshenlinzhi(DSLZ) on the cerebral ischemia reperfusion injury in the rats, and to explore its mechanism. Methods60 Wistar rats were randomly divided into sham group,model group,TanⅡA group, and low,middle,high, doses (5.0,10.0,20.0 mg·kg-1) of DSLZ groups(n=10). The thread embolism was performed to establish the rat models of focal cerebral ischemia reperfusion injury. The neurologic scores of the rats after 2 h ischemia and 22 h reperfusion were measured and the percentages of the cerebral infarction area of the rats were detected by TTC staining method; the pathomorphology of the brain tissue of the rats was detected by HE staining. The activities of superoxide dismutase (SOD) and levels of malondialdehyde(MDA),nitric oxide (NO) in the brain tissue of the rats were detected.ResultsCompared with sham group,the neurologic score of the rats in model group was increased(P<0.05),the percentages of the cerebral infarction area was increased(P<0.05),the activity of SOD was decreased(P<0.01) and the levels of MDA and NO were increased (P<0.01). Compared with model group,the neurologic scores of the rats in middle and high doses of DSLZ groups were decreased and the percentages of the cerebral infarction area were decreased,the activities of SOD were increased and the levels of MDA and NO were decreased(P<0.05 orP<0.01).The HE staining results showed the membrane of neurocyte was unclear,and the cells became swelling,deformation or necrosis,severe edema in interstitium and the cell space was enlarged in model group;the nucleolus could be found clearly and there was slight edema in interstitium of the cells of the rats in high dose of DSLZ group. ConclusionDSLZ has a protective effect on the cerebral ischemia reperfusion injury of the rats,and its mechanism may be related to the anti-radical damage and lessening the neurotoxicity of NO.

Danshenlinzhi; cerebral ischemia reperfusion injury; oxidative stress; superoxide dismutase; malondialdehyde

1671-587Ⅹ(2015)02-0291-04

10.13481/j.1671-587x.20150216

2014-10-29

吉林省科技厅创新型企业科技项目资助课题(20140310001)

曲圆(1989-)，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事股骨头缺血坏死的药物治疗方面的研究。

纪影实，副教授，硕士研究生导师(Tel:0431-85619799,E-mail:jiyingshi@126.com)

R541.4

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