Toll样受体激动剂对骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响

程千松 王兴兵 汪 健 虞国慧

230001合肥 安徽医科大学附属省立医院血液内科(王兴兵，汪健)

骨髓间充质干细胞(BM-MSC)是骨髓造血微环境中一种重要的多潜能非造血祖细胞，具有支持造血、调节干细胞龛位等多种功能。BM-MSC能够体外诱导定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元细胞等细胞类型［1，2］，参与组织损伤的修复及再生。研究［3］显示，BM-MSC 中有多种 Toll样受体(TLR)的表达，通过TLR激动剂活化BM-MSC能够调节其多种生物学功能。

目前，有关TLR活化对MSC的分化影响各家报道不一［4－6］。本文研究了BM-MSC体外诱导的多分化潜能，观察TLR激动剂对BM-MSC成骨和成脂分化能力的影响，以进一步探讨BM-MSC介导的组织损伤修复机制，并为提高其疗效寻找新的靶点。

1 材料及方法

1.1 TLR激动剂的制备 TLR2激动剂PAM3CSK4、TLR4激动剂LPS购自R＆D公司，予无菌PBS稀释到所需浓度备用。

1.2 骨髓间充质干细胞的分离培养 取健康志愿者的骨髓5mL(研究方案经医院伦理委员会批准，并获得研究对象的知情同意)，给予PBS 1∶1稀释后，加入淋巴细胞分离液中(密度:1.077g/mL，Solarbio公司)，400g离心20min分离出单个核细胞，给予PBS清洗一遍后弃上清，以含10%FBS(Gibco公司)、100U/L青霉素及100U/L链霉素的DMEM高糖培养基(Hyclone公司)按1×106/mL的密度转移于25cm2培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养 48h，后完全换液以去除悬浮细胞，以后每周换液2次。当细胞接近100%融合后，用含0.25%胰酶的消化液(Hyclone公司)消化，以1∶2的比例传代。

1.3 BM-MSC表面TLR2及TLR4的检测 取第3代BM-MSC，应用0.25%的胰蛋白酶消化并收获细胞，后用PBS充分洗涤及吹打后制成单细胞悬液，分别加入TLR2-FITC及TLR4-PE荧光标记的单克隆抗体(eBioscience公司)，在4℃，避光孵育20min后加PBS 1mL进行洗涤，弃去上清液，给予PBS 200mL进行重悬，应用振荡器振荡混匀后，24h内于FACS Caliber四色流式细胞仪检测，每次获取的细胞数为5000～10000，每种标记抗体分别加做空白对照及同型对照做为参考。

1.4 成脂诱导分化 将骨髓间充质干细胞以2×104/cm2的密度接种于6孔板，当细胞达到完全融合后，换成脂肪诱导分化培养基(内含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、1μmol/L 地塞米松、10μg/mL 胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基，广州赛业公司)，3d后换成脂肪诱导维持培养基(内含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基，赛业公司)。24h后，再将培养基换为脂肪诱导分化培养基。在诱导/维持3遍后，在脂肪诱导维持培养基中继续培养7d，吸除培养基并给予PBS清洗1次，给予2mL 4%的甲醛固定30min后PBS清洗2次，并且给予1mL油红O工作液染色30min，给予PBS清洗2～3次，在光学显微镜下观察并采集图像，随机观察5个不重叠视野，并在低倍镜下计数500个细胞，计算成脂率(含有脂质空泡的细胞数/总细胞数×100%)。

1.5 成骨诱导分化 将骨髓间充质干细胞以3×103/cm2的密度接种于明胶(sigma公司)包被的6孔板，24h后换成成骨诱导培养基(内含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL 链霉素、0.1μmol/L 地塞米松、50μmol/L 抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸盐的DMEM培养基，广州赛业公司)，后每3天给予新鲜成骨诱导培养基完全换液1次。培养3周后，吸除培养基，给予PBS冲洗1次，给予2mL 4%的甲醛固定30min，给予PBS清洗2次，并且给予茜素红工作液染色3～5min，给予PBS清洗2～3次，在光学显微镜下观察并采集图像，随机观察5个不重叠视野，并在低倍镜下计数500个细胞，计算形成钙化结节形成率(钙化结节染色阳性的细胞/总细胞数×100%)。

1.6 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，统计学分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)表面TLR2及TLR4的表达 取第3代BM-MSC进行流式细胞分析，研究发现，BM-MSC表面表达TLR2及TLR4，见图1。

2.2 人BM-MSC分化能力的鉴定 取第3代细胞进行分化实验。在成脂诱导分化培养中，培养3d后即可见部分细胞胞质内开始出现少量细小脂质空泡，后含有脂质空泡的细胞数量逐渐增加，且胞内脂质空泡数量增加并相互融合，同时细胞形状变形，由梭形变成椭圆形。培养2～3周后，胞质内充满脂质空泡并将胞核挤压至一侧，油红O染色后显示胞质内脂质空泡呈红色，胞核呈淡蓝色(图2)。在成骨诱导分化培养中，培养3～5d后可出现细胞外基质少量颗粒性钙盐沉积，细胞形状改变不明显，培养2～3周后，细胞外基质出现大量泥沙样钙盐沉积，部分融合呈块状，茜素红染色后显示细胞外基质大量红色钙盐沉积(图3)。

2.3 TLR激动剂对BM-MSC成脂及成骨分化能力的影响 分别在分化培养基中添加PAM3CSK4或LPS，终浓度均为100ng/mL，进行诱导分化实验。脂肪诱导分化3周后，对照组成脂率为(89.37±8.34)%，PAM3CSK4组为(87.50±6.50)%(P ＞0.05)，LPS 组为(85.45±7.62)%(P ＞0.05)，较空白组无明显差异(图4);成骨诱导分化2周后，对照组的钙化结节形成率为(53.50±5.97)%，PAM3CSK4及 LPS组分别为(75.80±10.32)%及(71.43±12.55)%，较对照组明显增加(t=4.582，P ＜ 0.05;t=3.160，P ＜0.05)，见图5。

2.4 TLR激动剂预刺激对BM-MSC成骨分化能力的影响 分别以100ng/mL的PAM3CSK4或100ng/mL的LPS预刺激BM-MSC 24h后，再将各组细胞进行成脂及成骨诱导分化3周，比较活化组及未活化组BMMSC分化能力改变情况。结果显示，活化组较未活化组成脂率及成骨分化能力均无显著性改变。

3 讨论

BM-MSC是骨髓中一种重要的多潜能干细胞，可通过其塑料黏附活性从其它细胞中分离出来，培养后呈成纤维样细胞。BM-MSC在体外能够在不同的分化培养基中诱导分化成不同的细胞类型［1，2，7］，其另一个特点是低表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类及共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)，而这些分子在抗原提呈及免疫反应中起重要作用，因此间充质干细胞能够逃避机体免疫系统的免疫监视［3］，这些特点使MSC成为细胞治疗及再生医学中重要的细胞治疗工具。

TLR做为分布于免疫细胞上的一种模式识别受体，能够识别外源性病原菌、启动固有免疫反应及调节适应性免疫反应;TLR还能够识别各种内源性配体，如热休克蛋白(HSP)，高迁移率族蛋白B1等，参与组织损伤的修复［8］。多项研究［9，10］还表明，TLR 与胰腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发病及治疗密切相关。最近研究表明，BM-MSC表达多种TLR，并且在给予TLR激动剂活化后能够调节其多种生物学功能。我们的研究表明，人BM-MSC表达TLR1-6，并在体外证实TLR2激动剂(PAM3CSK4)和(或)TLR4激动剂(LPS)活化的BMMSC能促进脐血CD34+T细胞的增殖和向髓系分化，且这一作用可能与PAM3CSK4和LPS显著上调MSC造血相关细胞因子的分泌有关［11］。Liotta等［6］研究显示，人BM-MSC在给予TLR3、4活化后，能够抑制其对T细胞的免疫调节活力。Tomchuck等［12］研究显示，TLR可活化人BM-MSC内信号产道通路，介导多种细胞因子、趋化因子的产生，并且增强BM-MSC的体外迁移功能。

有关TLRs活化对MSC的分化影响各家报道不一。Lombardo等［4］发现，TLR3激动剂(Poly I:C)和TLR4激动剂(LPS)可促进人脂肪来源的MSC(ADMSC)向成骨分化，但对其脂肪分化无影响。Hwa等研究发现LPS及TLR2激动剂(肽聚糖)能够促进ADMSC向成骨分化［5］，他们均报道肽聚糖会降低脂肪分化。Mo等［13］报道，在LPS长时间刺激BM-MSC后，会促进其向成骨分化。而Liotta等［6］研究发现，TLR激活对于BM-MSC的成骨，软骨及脂肪分化均无明显影响。众多研究结果不一致可能与TLR激动剂刺激时间、激动剂浓度、MSC来源不用等因素有关。实验中，我们证实了在诱导分化培养中，人BM-MSC能够定向分化为成骨及脂肪细胞，TLR2及TLR4激动剂能促进人BM-MSC向成骨细胞分化，不影响其向脂肪细胞分化。进一步研究显示，TLR激动剂短暂预刺激活化细胞并不影响其成骨分化能力，这提示PAM3CSK4及LPS促进人BM-MSC成骨分化需要TLR激动剂的持续暴露，与TLR短暂的活化无关。

研究证实，循环中的间充质干细胞能够迁移到组织损伤部位进行组织修复功能，同时间充质干细胞具有多分化潜能及免疫抑制能力，故已广泛应用于组织损伤、移植物抗宿主病、心肌梗死等疾病治疗中［14，15］。在组织损伤过程中，有大量细胞内外降解产物的释放，而这些产物中含有大量TLR的内源性配体，这些内源性配体通过活化植入体内的间充质干细胞表面的TLR，可能对其组织损伤修复功能起到重要调节作用。

总之，PAM3CSK4及LPS能够促进BM-MSC向成骨细胞分化，这种作用需要其持续暴露于分化培养基中，这对组织工程研究及组织损伤后间充质干细胞移植研究具有重要意义。对于TLR受体激动剂对间充质干细胞其他分化潜能的影响及其体内作用机制值得进一步深入研究。

［1］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411):143－147.

［2］陈刚，秦尚振，马廉亭，等.成人骨髓间充质干细胞的培养及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究［J］.中华器官移植杂志，2006，27(2):107－110.

［3］DelaRosa O，Lombardo E.Modulation of adult mesenchymal stem cells activity by toll-like receptors:implications on therapeutic potential［J/OL］.Mediators Inflamm，2010:865601.

［4］Lombardo E，DelaRosa O，Manche n～o-Corvo P，et al.Tolllike receptor-mediated signaling in human adipose-derived stem cells:implications for immunogenicity and immunosuppressive potential［J］.Tissue Engineering Part A，2009，15(7):1579－1589.

［5］Hwa Cho H，Bae YC，Jung JS.Role of toll-like receptors on human adipose-derived stromal cells［J］.Stem Cells，2006，24(12):2744－2752.

［6］Liotta F，Angeli R，Cosmi L，et al.Toll-like receptors 3and 4are expressed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and can inhibit their T-cell modulatory activity by impairing notch signaling［J］.Stem Cells，2008，26(1):279–289.

［7］Charbord P.Bone marrow mesenchymal stem cells:historical overview and concepts［J］.Hum Gene Ther，2010，21(9):1045－1056.

［8］Zhang Z，Schluesener HJ.Mammalian toll-like receptors:from endogenous ligands to tissue regeneration［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63(24):2901－2907.

［9］王正林，余宏铸，许业传.Toll样受体与胰腺癌发病以及治疗的研究进展［J］.安徽医学，2014，35(5):696－699.

［10］伍宏亮，张青川.对TLR4的认识及其与前列腺癌研究进展［J］.中华全科医学，2013，11(3):461－462.

［11］Wang X，Cheng Q，Li L，et al.Toll-like receptors 2and 4mediate the capacity of mesenchymal stromal cells to support the proliferation and differentiation of CD34(+)cells［J］.Exp Cell Res，2012，318(3):196－206.

［12］Tomchuck SL，Zwezdaryk KJ，Coffelt SB，et al.Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responses［J］.Stem Cells，2008，26(1):99－107.

［13］Mo IF，Yip KH，Chan WK，et al.Prolonged exposure to bacterial toxins downregulated expression of toll-like receptors in mesenchymal stromal cell-derived osteoprogenitors［J］.BMC Cell Biol，2008，9:52.

［14］Yin F，Battiwalla M，Ito S，et al.Bone marrow mesenchymal stromal cells to treat tissue damage in allogeneic stem cell transplant recipients:correlation of biological markers with clinical responses［J］.Stem Cells，2014，32(5):1278－1288.

［15］van den Akker F，de Jager SC，Sluijter JP.Mesenchymal stem cell therapy for cardiac inflammation:immunomodulatory properties and the influence of toll-like receptors［J/OL］.Mediators Inflamm，2013，181020.